指甲油类：称取0.5 g（精确至0.001 g）样品，置10 mL具塞比色管中，加5～6 mL乙腈（3.1），混匀，超声提取30 min，放至室温，加乙腈（3.1）稀释至刻度，摇匀，静置，必要时，转移至10 mL具塞塑料离心管中，以10000 rpm离心5 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为试样溶液备用。
　　若样品中被测成分的浓度超过了线性范围的上限，需对试样溶液进行适当稀释处理。
　　5.2　高效液相色谱参考条件
　　色谱柱：C₁₈柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。
　　流动相：A：乙腈
　　B：缓冲溶液（10 mmol/L四丁基氢氧化胺（3.6），10 mmol/L 柠檬酸（3.7），用氨水（3.8）调节至pH 8.2）
　　梯度洗脱，洗脱程序见表1。
　　表1　梯度洗脱程序

时间（min）	流动相A（%）	流动相B（%）	流速（mL/min）
0.00	30	70	1.0
5.00	80	20	1.0
10.00	100	0	1.0
15.00	100	0	1.0
20.00	30	70	1.0
22.00	30	70	1.0

　　流速：1.0 mL/min。
　　检测波长：416 nm（酸性黄36）；484 nm（颜料橙5、颜料红53：1、苏丹红Ⅱ）；514 nm（苏丹红Ⅳ）。
　　柱温：30℃。
　　进样量：10 µL。
　　5.3　样品测定
　　按设定的色谱条件（5.2），取着色剂系列标准溶液（3.20）分别进样，进行高效液相色谱分析，以系列标准溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，建立标准曲线，得到回归方程。取试样溶液（5.1）进样10 μL分析，色谱图检出的成分，经与该成分的保留时间和紫外-可见光谱图比较确证后，根据测定成分的峰面积，代入回归方程计算各着色剂的浓度。按“6”项下计算公式计算化妆品样品中着色剂的含量。
　　5.4　平行试验
　　按以上步骤操作，对同一样品独立进行测定，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。
　　5.5　阳性结果确证
　　测定过程中若有阳性结果，可采用液相色谱-质谱联用法进一步确证。
　　在相同的实验条件下，如果检出的色谱峰的保留时间和紫外-可见光谱图与对照品一致，所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子对相对丰度比的偏差不超过表2规定范围，则可判定样品中存在对应的待测成分。

　　表2　阳性结果确证时相对离子丰度比的最大允许偏差

相对离子丰度	＞50%	＞20%至50%	＞10%至20%	≤10%
允许的相对偏差	±20%	±25%	±30%	±50%

　　液相色谱-质谱联用法参考条件：
　　色谱参考条件：
　　色谱柱：C₁₈（2.1 mm×150 mm， 3.5 μm）；
　　流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液系统梯度洗脱，梯度洗脱条件见表3；
　　柱温：30 ℃；
　　流速：0.3 mL/min；
　　进样量：5 µL。
　　表3　梯度洗脱条件

时间（min）	乙腈（%）	0.1%甲酸溶液（%）	流速（mL/min）
0.00	78	22	0.3
3.00	78	22	0.3
5.00	95	5	0.3
7.00	95	5	0.3
8.00	78	22	0.3

　　质谱参考条件：
　　毛细管电压：3.5 kV；
　　二级锥孔电压：5 V；
　　射频透镜电压：0.5 V；
　　离子源温度：150 ℃；
　　脱溶剂气温度：500 ℃；
　　脱溶剂气流量：1000 L/hr；
　　锥孔气流量：50 L/hr；
　　碰撞室压力：3.2×10^-3 mbar；
　　低质量端1分辨率：13.0；
　　高质量端1分辨率：13.0；
　　离子能量1：0.5 V；
　　碰撞室入口电压：-2 eV；
　　碰撞室出口电压：1 eV；
　　低质量端2分辨率：13.0；
　　高质量端2分辨率：13.0；
　　离子能量2：0.5 V；
　　光电倍增器电压：650 V；
　　碰撞气体：氩气；
　　数据采集模式：多反应监测。
　　在以上色谱、质谱条件下，5种禁用着色剂的定性离子对和保留时间见表4。
　　表4　5种禁用着色剂的定性离子对和保留时间

着色剂名称	定性离子对（m/z）	保留时间（min）
颜料橙5	339.2/156.2，339.2/128.2	2.56
酸性黄36	354.2/169.2，354.2/109.2	3.33
颜料红53：1	377.2/221.2，377.2/128.2	4.11
苏丹红Ⅳ	381.4/128.2，381.4/106.2	5.40
苏丹红Ⅱ	277.2/156.2，277.2/128.2	5.96

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