称取样品0.5g，精确至0.001g，置于25mL具塞刻度管中，加入20 mL甲醇（3.2），涡旋振荡1 min，超声（功率：400W）提取15min，取出，冷却至室温后用甲醇（3.2）定容至25mL，混匀，经0.45 mm滤膜过滤，滤液作为待测样液，备用。
5.2 测定
5.2.1 色谱条件
色谱柱：CN 柱，250 mm×4.6mm，5 mm；
流动相：甲醇＋0.1mol/L醋酸铵缓冲溶液（冰醋酸调pH至5.0）（75＋25）；
流速：1.0 mL/min；
检测波长：260nm；
柱温：25℃；
进样量：20mL。
5.2.2 测定方法
取标准工作溶液分别进样，以目标峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标进行线性回归，建立三条标准工作曲线。取“5.1”项下处理得到的待测溶液进样，根据测定成分的峰面积，分别代入三条标准工作曲线上，得出苄索氯铵、劳拉氯铵和西他氯铵的质量浓度。按“6计算”，计算样品中苄索氯铵、劳拉氯铵和西他氯铵的含量。
5.3 平行实验
按以上步骤操作，对同一样品独立进行测定获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
6 计算
W＝（DrV/ m*10
6）*100
式中：
w --化妆品中苄索氯铵、劳拉氯铵和西他氯铵的质量分数，%；
m -- 样品取样量，g；
ρ-- 从标准工作曲线上查得的待测样液中苄索氯铵、劳拉氯铵和西他氯铵的质量浓度，mg/mL；
V -- 样品定容体积，mL；
D -- 稀释倍数。
7 回收率与精密度
方法的回收率为87%～107.3%，相对标准偏差小于6%（n＝6）。
8 色谱图
图 标准溶液的高效液相色谱图（略）
色谱峰：1.劳拉氯铵；2.苄索氯铵；3.西他氯铵
附件15：
化妆品中颜料橙5等5种禁用着色剂的检测方法
1 适用范围
本方法规定了唇膏、散粉和指甲油类化妆品中酸性黄36（CI 13065）、颜料橙5（CI 12075）、颜料红53：1（CI 15585：1）、苏丹红Ⅱ（CI 12140）和苏丹红Ⅳ（CI 26105）的高效液相色谱测定方法。
本方法适用于唇膏、散粉和指甲油类化妆品中酸性黄36、颜料橙5、颜料红53：1、苏丹红Ⅱ和苏丹红Ⅳ的测定。
2 方法提要
样品经溶剂提取后，用高效液相色谱仪分离，二极管阵列检测器检测，以保留时间和紫外-可见光谱图定性，峰面积外标法定量。必要时，采用液相色谱-质谱联用法进行确证。本方法对酸性黄36、颜料橙5、颜料红53：1、苏丹红Ⅱ和苏丹红Ⅳ的检出限、定量下限、检出浓度和最低定量浓度见表1。
表1 5种着色剂的检出限、定量下限、检出浓度和最低定量浓度
着色剂名称
| 检出限
（ng）
| 定量下限
（ng）
| 检出浓度
（μg/g）
| 最低定量浓度
（μg/g）
|
酸性黄36
| 2.0
| 5.0
| 3.0
| 6.0
|
颜料橙5
| 2.0
| 5.0
| 3.0
| 6.0
|
颜料红53：1
| 5.0
| 8.0
| 4.0
| 10.0
|
苏丹红Ⅱ
| 2.0
| 5.0
| 3.0
| 6.0
|
苏丹红Ⅳ
| 2.0
| 5.0
| 3.0
| 7.0
|
3 试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为实验室用一级水。
3.1 乙腈，色谱纯。
3.2 甲醇，色谱纯。
3.3 四氢呋喃，色谱纯。
3.4 二甲基亚砜。
3.5 乙醇，色谱纯。
3.6 四丁基氢氧化铵，浓度为55%。
3.7 柠檬酸。
3.8 氨水，浓度为25～28%。
3.9 酸性黄36，纯度≥99%。
3.10 苏丹红Ⅳ，纯度≥94%。
3.11 苏丹红Ⅱ，纯度≥90%。
3.12 颜料橙5，纯度≥97%。
3.13 颜料红53：1，纯度≥95%。
3.14 酸性黄36标准储备溶液（ ＝500 μg/mL）：称取酸性黄36（3.9）对照品50 mg（精确至0.1 mg），置于100 mL容量瓶中，用甲醇（3.2）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得500 μg/ mL的标准储备溶液。
3.15 苏丹红Ⅳ标准储备溶液（ ＝500 μg/mL）：称取苏丹红Ⅳ（3.10）对照品50 mg（按实际含量折算，精确至0.1 mg），置于100 mL容量瓶中，用四氢呋喃（3.3）和乙腈（3.1）混合液（体积比 1：9）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得500 μg/ mL的标准储备溶液。
3.16 苏丹红Ⅱ标准储备溶液（ ＝500 μg/mL）：称取苏丹红Ⅱ（3.11）对照品50 mg（按实际含量折算，精确至0.1 mg），置于100 mL容量瓶中，用乙腈（3.1）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得500 μg/ mL的标准储备溶液。
3.17 颜料橙5标准储备溶液（ ＝250 μg/mL）：称取颜料橙5（3.12）对照品25 mg（按实际含量折算，精确至0.1 mg），置于100 mL容量瓶中，用四氢呋喃（3.3）、二甲基亚砜（3.4）和乙腈（3.1）的混合溶液（体积比5：1：4）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得250 μg/ mL的标准储备溶液。
3.18 颜料红53：1标准储备溶液（ ＝250 μg/mL）：称取颜料红53：1（3.13）对照品25 mg（按实际含量折算，精确至0.1 mg），置于100 mL容量瓶中，用二甲基亚砜（3.4）和乙醇（3.5）的混合溶液（体积比2：3）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得250 μg/ mL的标准储备溶液。
3.19 着色剂混合标准储备溶液（ ＝50 μg/mL）：分别称取酸性黄36标准储备液（3.14）、苏丹红Ⅳ标准储备溶液（3.15）和苏丹红Ⅱ标准储备溶液（3.16）各5 mL，取颜料橙5标准储备溶液（3.17）和颜料红53：1标准储备溶液各10 mL，置于50 mL容量瓶中，用乙腈（3.1）溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度各为50 μg/mL的标准溶液。
3.20 5种禁用着色剂系列标准溶液：精密量取一定体积的混合标准储备溶液（3.20），置10 mL容量瓶中，加乙腈（3.1）稀释至刻度，使得着色剂各成分的浓度分别为0.2 μg/ mL、0.5 μg/ mL、2.0 μg/ mL、10.0 μg/ mL、50.0 μg/ mL。
4 仪器
4.1 高效液相色谱仪：配二极管阵列检测器。
4.2 液相色谱-串联四极杆质谱联用仪。
4.3 分析天平：感量为0.0001 g。
4.4 分析天平：感量为0.00001 g。
4.5 精密移液器。
4.6 涡旋振荡器。
4.7 超声波清洗仪。
4.8 高速离心机：转速不小于10000 rmp。
5 分析步骤
5.1 样品预处理
唇膏类：称取0.5 g（精确至0.001 g）样品，置10 mL具塞比色管中，加四氢呋喃（3.3）与乙腈（3.1）混合液（体积比1：9）至刻度，摇匀，涡旋振荡使试样与提取溶剂充分混匀，超声提取30 min，放至室温，必要时，转移至10 mL具塞塑料离心管中，以10000 rpm离心5 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为试样溶液备用。
散粉类：称取0.5 g（精确至0.001 g）样品，置10 mL具塞比色管中，加四氢呋喃（3.3）、二甲基亚砜（3.4）和乙腈（3.1）混合液（体积比1：1：8）至刻度，混匀，超声提取30 min，放至室温，上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为试样溶液备用。
