6 计算
w＝ ρV/m
式中：
w -- 样品中着色剂的质量分数，μg/g；
-- 从标准曲线中得出的测试溶液中着色剂的质量浓度，μg/mL；
V -- 样品定容体积，mL；
m -- 样品取样量，g。
7 回收率和精密度
两个浓度水平中，低浓度的平均提取回收率和平均方法回收率在80%～120%之间，并且RSD小于10%（n＝6）；高浓度的平均提取回收率和平均方法回收率在85%～115%之间，并且RSD小于5%（n＝6）。
8 色谱图
图 5种禁用着色剂混合标准溶液（5 μg/mL）色谱图（略）
1. 酸性黄36；2. 颜料红53：1；3. 颜料橙5；4. 苏丹红Ⅱ；5. 苏丹红Ⅳ
附件16：
化妆品中呋喃香豆素类
（三甲沙林、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素）
和欧前胡内酯的检测方法
1 适用范围
本方法规定了用高效液相色谱法测定化妆品中呋喃香豆素类（三甲沙林、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素）和欧前胡内酯的方法。
本方法适用于化妆品中呋喃香豆素类（三甲沙林、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素）和欧前胡内酯含量的测定。
2 方法提要
样品在经过提取后，用高效液相色谱仪分离，二极管阵列检测器检测，经与平行操作的三甲沙林、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素和欧前胡内酯对照品比较，以保留时间和紫外光谱图定性，峰面积定量，以标准曲线法计算含量。必要时，采用液相色谱-质谱方法（LC-MS/MS）进行确证。本方法对三甲沙林、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素和欧前胡内酯的检出限、定量限和取样品0.5 g时的检出浓度、定量浓度见表1。
表1 4种香豆素类成分的检出限和检出浓度
化合物
| 检出限
（ng）
| 定量限
（ng）
| 检出浓度
（μg/g）
| 定量浓度
（μg/g）
|
三甲沙林
| 0.13
| 0.25
| 0.26
| 0.50
|
8-甲氧基补骨脂素
| 0.13
| 0.27
| 0.26
| 0.54
|
5-甲氧基补骨脂素
| 0.05
| 0.26
| 0.10
| 0.52
|
欧前胡内酯
| 0.15
| 0.29
| 0.30
| 0.58
|
3 试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为实验室用一级水。
3.1 甲醇，色谱纯。
3.2 三甲沙林，纯度≥99%。
3.3 8-甲氧基补骨脂素，纯度≥98%。
3.4 5-甲氧基补骨脂素，纯度≥99%。
3.5 欧前胡内酯，纯度≥99%。
3.6 混合标准储备溶液 [ （待测成分）＝10 μg/mL]：分别称取三甲沙林（3.2）、8-甲氧基补骨脂素（3.3）、5-甲氧基补骨脂素（3.4）和欧前胡内酯（3.5）对照品各5 mg（精确到0.1 mg），置5 mL量瓶中，用甲醇（3.1）溶解并稀释至刻度，摇匀，配置成质量浓度各为1 mg/mL的标准溶液。精密量取各标准溶液0.5 mL置50 mL量瓶中，加甲醇（3.1）稀释至刻度，摇匀，即得10 μg/ mL的混合标准储备溶液。
3.7 系列浓度标准溶液：精密量取一定体积的混合标准储备溶液（3.6），置10 mL量瓶中，加甲醇（3.1）稀释至刻度，配制得各待测成分的质量浓度分别为0.05 μg/ mL、0.1 μg/ mL、0.5 μg/ mL、1.0 μg/ mL、5.0 μg/ mL、10.0 μg/ mL的系列浓度标准溶液。
4 仪器
4.1 高效液相色谱仪：具二极管阵列检测器。
4.2 液相色谱-三重串联四级杆质谱联用仪。
4.3 分析天平：感量为0.1 mg。
4.4 移液器。
4.5 涡旋振荡器。
4.6 超声波清洗仪（功率不低于200W）。
4.7 高速离心机：转速不小于10000 r/min。
5 测定步骤
5.1 样品预处理
膏、霜、乳类：称取0.5 g（精确至0.1 mg）样品，置10 mL量瓶中，加6 mL甲醇（3.1），涡旋振荡使试样与提取溶剂充分混匀，超声提取20 min，放至室温，加甲醇（3.1）稀释至刻度，摇匀，转移至10 mL具塞塑料离心管中，以12000 r/min离心5 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液备用。
液体类：称取0.5 g（精确至0.1 mg）样品，置10 mL量瓶中，加甲醇（3.1）稀释至刻度，混匀，必要时，转移至10 mL具塞塑料离心管中，以12000 r/min离心5 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液备用。
固体粉类：称取0.5 g（精确至0.1 mg）样品，置10 mL量瓶中，加8 mL甲醇（3.1），混匀，超声提取20 min，放至室温，加甲醇（3.1）稀释至刻度，摇匀，静置，必要时，转移至10 mL具塞塑料离心管中，以12000 r/min离心5 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液备用。
若样品中被测成分的浓度超过了线性范围的上限，需对待测溶液进行适当稀释处理。
5.2 高效液相色谱参考条件
色谱柱：C
18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂）或具有同等柱效的色谱柱。
流动相：甲醇＋水，梯度洗脱，洗脱程序见表2。
表2 流动相甲醇和水梯度洗脱程序（体积比）
时间/min
| 0
| 15
| 16
| 19
| 20
|
甲醇＋水
| 70＋30
| 90＋10
| 100＋0
| 100＋0
| 70＋30
|
注：梯度洗脱条件，操作者可根据样品的不同选择最佳条件，使待测成分与其他组分峰获得完全分离。
流速：1.0 mL/min。
检测波长：248 nm。
柱温：30℃。
进样量：10 µL。
5.3 样品测定
按设定的色谱条件（5.2），取系列浓度标准溶液（3.7）分别进样，进行高效液相色谱分析，以系列浓度标准溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，建立标准曲线，得到回归方程。取待测溶液（5.1）进样10 μL分析，色谱图检出的成分，经与该成分的保留时间和紫外光谱图比较确证后，根据待测成分的峰面积，代入回归方程计算待测成分的浓度。按“6”项下计算公式计算化妆品样品中呋喃香豆素类成分的质量分数。
5.4 平行试验
按以上步骤操作，对同一样品独立进行测定，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。
