11．结果观察和判断
4 h以后，从孵箱中取出，倒掉补体，进行结果观察。
（1）阳性对照血清应出现清晰，而不是模糊或不透明的溶血圈，并溶血圈面积比预实验的不能相差1.5 倍或以上；阴性对照血清不应出现任何溶血圈。
（2）正常红细胞对照板不应出现任何溶血圈。
（3）恢复期血清溶血圈面积应为急性期的≥2 倍表示有意义的差异；两者相差＜1.5 倍为实验误差；两者相差1.5 倍或以上但不到2 倍，需重复测定，如仍相差1.5 倍或以上但不到2 倍，可判为有意义差异。如重复测定相差为＜1.5倍，表示为实验误差。
不配对血清测定时，2mm孔径的，溶血圈直径需≥4mm（溶血圈面积≥9.42mm
2）；3mm孔径的，溶血圈直径需≥5mm（溶血圈面积≥12.57mm
2）可认为是阳性血清。
12．注意事项
（1）抗原量一定要掌握准确，量过大一方面使测定敏感性下降，另一方面由于过量的病毒颗粒吸附在红细胞表面，红细胞不易吹散开，铺板时易出现芝麻样颗粒，过少的红细胞溶解不清晰或不溶解。
（2）血清尽量避免反复冻融，因反复冻融会产生抗补体影响溶血圈的清晰度。
（3）双份配对的血清应在同一块板上进行测定，以便避免板间的误差。
（4）阳性对照血清，有时由于滴度过高，出现很大的溶血圈，把邻近的孔覆盖，因此，最好靠近它的孔不加样本或将阳性血清进行适当稀释，如1：5 稀释，而后使用之。
（5）对患者进行血清学诊断时，建议用3mm 孔径的孔，因用2mm 孔径有时会出现重叠溶血圈影响结果准确的判断。进行血清流行病学调查时建议用2mm 孔径。
（6）测量溶血圈直径时，应测量最清晰的，因标准的溶血圈常为靠近孔边缘出现清晰透亮的溶血圈，它的外围出现不十分清晰的溶血圈，此溶血圈外围又有个清晰的溶血圈，这是要测量的直径。测量时，尺子要挨在扩散板上。
（7）正常红细胞对照板所出现的溶血圈面积与实验板几乎一样大小，表明嗜异性抗体未完全去除干净，应再用鸡红细胞进行再吸附来去除之；如对照板所出现的溶血圈面积比实验板小2 倍或以上，一般不影响对实验结果的判断。
（8）琼脂糖最好用高纯度，低熔点，在有效期内，新鲜配制的，配好后保存期不超过一个月，因保存期过长，铺板时易造成琼脂板出现裂缝。
（9）一定要加1‰NaN
3 以防止细菌生长，因细菌会造成非特异性溶血。
（10）温度一定要控制好，因补体不耐热，操作补体时间尽量要缩短，并在4℃下操作；补体一定为≥6 只豚鼠的混合血清。
（11）禽类血清不结合豚鼠补体，不应用鸡的抗血清作为阳性对照血清。
（12）如缺乏时间对实验结果进行观察和测量，可将实验板置4℃冰箱，至少一星期进行测量不影响实验结果；溶血板制备完后，平放带湿度的盒中，置4℃冰箱，最长只能存两星期。
三、A 型流感病毒RT-PCR 检测
（一）生物安全要求
分装标本、裂解病毒需在BSL-2 级实验室生物安全柜内操作。核酸检测区域要分出试剂配制、核酸提取、扩增、检测的不同分区。
（二）主要材料
1．提RNA Kit：QIAGEN RNeasy Mini Kit （catalog #74104）
2．β－巯基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115）
3．70％乙醇
4．RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212）
5．PromegaRNasinRibonuclease Inhibitor （catalog #N2111）
6．检测引物：Forword and Reverse Primers（均为10μM），序列如下：
类型
| 序列
|
甲型通用
| FluA-M-F30
| 5’- TTC TAA CCG AGG TCG AAA CG -3’
|
FluA-M-R264
| 5’- ACA AAG CGT CTA CGC TGC AG -3’
|
（三）实验步骤
1．RNA 提取
（1）根据标本数量分装RLT 液：从Kit 中取出RLT 液，用1.5mL 离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。
（2）加标本100ul 到裂解液中。
（3）每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。
（4）从Kit 中取出带滤柱的2mL 收集管，打开包装将其做好标记。取步骤2中的混合液600μL 加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。
（5）滤柱仍放回收集管上，将步骤2 剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。
（6）于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1 液，12000rpm，离心15s。
（7）从QIAGEN RNeasy Mini Kit 中取一支干净的2mL 收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE 液，12000rpm，离心15s。
（8）弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE 液，13000～14000rpm，离心2min。
（9）将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf 管上，向滤柱中加入30～50μL的Rnase-free Water，室温静置1～3min。
（10）12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。注意：Buffer RPE 使用之前加无水乙醇。
2．反应体系配制
（1）实验设计：检测标本RNA 时，阴性对照用无菌水，阳性对照用已知病毒RNA。
（2）PCR 反应体系配制（在体系配制区配反应液）
2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR 小管中，每管20μL，分别做好标记。
3）加RNA 模板（在核酸提取区）
将上述分装好的PCR 小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL 无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。
（3）RT-PCR
将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR 仪进行RT-PCR扩增，反应程序如下：
1）60℃作用1min， 2）42℃作用10min， 3）50℃作用30min
4）95℃作用15min， 5）94℃变性30s， 6）50℃退火30s，
7）72℃延伸1min，回到第5 步，34 个循环， 8）72℃作用10min，
9）4℃保存
（4）RT-PCR 产物检测：
1）将制备好的1.5％琼脂糖凝胶入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。
2）PCR 产物各取10μL，加入2μL 上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR 产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。
3）观察结果并用凝胶成像系统拍照记录。
（四）结果判断：
在系统成立，即阴阳性参考均正常的条件下，判断结果，阳性各条带为：
甲型（210bp）出现特异性条带，判为阳性结果。未出现条带，或不在上述位置出现非特异性条带，均判为阴性结果。
四、A型流感病毒实时荧光定量PCR检测
实时荧光定量（Real-time）RT-PCR 技术，是指在RT-PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个RT-PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法。如下是几个在结果判断中涉及到的几个概念：
图1：Real-Time RT-PCR 反应标准曲线（图略）
1．阈值（threshold）：PCR 反应前15 个循环荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是6～15 个循环荧光信号标准偏差的10 倍。
2．基线（baseline）：指PCR 反应指数扩增前平均本底荧光信号值，通常取6～15 个循环的平均荧光信号值。
3．Ct 值：C 代表Cycle，t 代表threshold。Ct 值是指反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
4．Ct 值与起始模板的关系：每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct 值。因此，只要获得未知样品的Ct 值，可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
（一）生物安全要求
分装标本、裂解病毒需在BSL-2 级实验室生物安全柜操作。核酸检测区域要分出试剂配制、核酸提取、扩增、检测的不同分区。
（二）主要材料
1．核酸提取Kit：QIAGEN 公司 RNeasy Mini Kit， Cat No.74104。
