2、职业暴露人群血清流行病学监测开展情况（30分，有一项不达标扣5分，全年未开展不得分）
开展时间： 月 日～ 月 日 流调人数： 采样数：
信息录入时间： 月 日 送样时间： 月 日
督导人员： 督导时间：
附录1
标本的采集、处理、保存与运输
一、血清标本的采集、处理和运输
（一）血清标本的采集
采集监测对象空腹静脉血5mL。（如果存在困难，可考虑在饭后2 小时后采血），使用真空负压采血套装管或注射器均可，同时做好标记，采集后填写附表3。
（二）血清标本的处理和保存
1. 如采集当日不能及时对标本进行处理，则可将采血管放4℃过夜，标本在4℃过夜放置后血清会自然析出，次日直接离心即可，2000rpm～3000rpm离10min。如有个别未析出血清的，可将血清采样管放置于37℃水浴锅或37℃培养箱内30min-1h后再离心。
2. 如当日即可处理血清标本，则将血清采样管放置于37℃水浴锅或37℃培养箱内30min-1h，使血清析出。血清析出后，2000rpm～3000rpm离心10min。
3. 在生物安全柜内分装血清标本。采用带外螺旋盖的冻存管进行标本分装，分装好的标本放置在冻存盒内。
3.1根据采样登记表上的信息，在冻存管上贴好相应的标签。血清标本一分为三，1 份用于省CDC 统一检测，1 份由省CDC 保存备份，1 份送国家流感中心检测（保证有1mL）。分装后的标本需置-20℃或以下保存，尽量避免反复冻融。
3.2 血清分装完成后，填写附表5。并在监测系统中录入标本相关信息。
（三）血清标本的送检和运输
血清标本采集后标本放入专用运输箱内（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料，同时付采样登记表（附表3）。标本采集后及时送省疾病预防控制中心急传所实验室收。
二、环境标本的采集、处理、保存和运输
（一）标本的采集和处理
1.采样液
环境标本采样液可使用Hank''s 或Eagle''s 等培养液加入以下抗菌素和0.5%BSA：氨苄青霉素 （2 x 106 IU/L）、链霉素 （200 mg/L） 、多粘菌素 B （2 x106 IU/L） 、庆大霉素 （250 mg/L） 、制霉菌素 （0.5 x 106 IU/L） 、盐酸氧氟沙星 （60 mg/L）、磺胺甲基异恶唑 （200 mg/L）。
2.标本种类、采集方法及处理
（1）水标本
在禽类活动或笼具旁的水沟或水池的不同部位共收集水标本5-10ml 置于15ml 外螺旋盖的管内。水样标本到实验室后应在采样管中加入上述抗生素和0.5%BSA，再进行分装。如果采集的水标本中存在固体等物质，应将采集的标本在无菌条件下反复吹打，以便打碎固体物质，置4℃待其自然沉淀30min，也可3000rpm 离心10min，取上清进行分装。
（2）笼具表面标本
每个笼具采集一份标本放在一个单独的采样管中。用蘸有采样液的带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭笼具表面禽类最常接触的3-5个不同部位（包括笼具底部），然后将擦拭过的拭子放入含5ml采样液的采样管中，尾部弃去。也可以用多个拭子充分擦拭笼具表面后放到一个采样管中。环境标本要在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以便打碎固体，置4℃待其自然沉淀30min，也可3000rpm 离心10min，取上清进行分装。
（3）宰杀或摆放禽肉案板表面的擦拭标本
如果宰杀或摆放禽肉使用不同的案板，可采集擦拭标本放到不同的采样管中。方法与采集笼具表面擦拭标本的方法相同，拭子要擦拭禽肉接触最多的部位。
（4）粪便标本
从禽舍或环境中采集新鲜禽类粪便样品3-5g 左右，放入含5ml 采样液的采样管中。采集的粪便标本要在无菌条件下反复吹打，以便打碎粘液和固体物质，置4℃待其自然沉淀30min，也可3000rpm 离心10min，取上清进行分装。
（5）清洗禽类的污水
如果有清洗禽类的污水盆或桶，可采集清洗禽类的污水标本。将水槽中的水样用无菌的、一次性的玻璃棒或棉签充分混匀后采集5-10ml置于15ml外螺旋盖的管内。水样标本到实验室后应在采样管中加入抗生素和0.5%BSA，再进行分装。方法与采集水标本相同。
（6）禽类饮用水
在每个笼具旁的饮水槽采集一份饮用水标本。方法与采集清洗禽类的污水标本的方法相同。
（7）其他
包括地面污水、地面灰尘及笼具垫草等。
（二）环境标本保存和送检
环境可置4℃存放2天，存放超过2天需置-70℃或以下保存。环境标本处理后，将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份保存备用，一份备用送国家流感中心，送检量不少于1.5 ml。检出阳性后一周内送省疾控急传所实验室后统一运送国家流感中心。所有标本要求-70℃或以下保存，在收到国家流感中心复核鉴定报告后，病毒分离阳性和病毒分离阴性的标本均需按照生物安全有关规定处理。
（三）标本运输
标本放入专用运输箱内（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同时寄送标本登记表。运输要求符合国家生物安全有关规定。病原学标本按B 类感染性物质进行运输。
三、运送地址和联系方式
地址：南京市鼓楼区江苏路172号
联系电话： 025－83759529， 025-83759339，025-83759404
传真： 025－83759409
资料提交邮箱：xuke923@163.com
附录2
流感监测网络实验室名单编号
扬州市疾病预防控制中心：026
常州市疾病预防控制中心：175
淮安市疾病预防控制中心：179
宿迁市疾病预防控制中心：183
附录3
实验室操作方法简介
一、马红细胞血凝抑制试验检测禽流感抗体
（一）生物安全要求
禽流感H5N1 亚型检测抗原的灭活需要在BSL-3 级实验室进行。其余操作均在BSL-2 级实验室进行。
（二）材料
1．抗原：灭活的H5N1 流感病毒。
2．血清：（1）阳性对照血清；阴性对照血清（2）待检血清
3．其他主要试剂：
（1）马红细胞（1：1 的比例保存于阿氏液中，建议采血后72 小时内使用）
（2）磷酸盐缓冲液（PH 7.2 PBS）：0.01M；（3）牛血清白蛋白（BSA）；（4）霍乱滤液（RDE）
4．其他：
（1）“V”型96 孔微量板
（2）37℃及56℃水浴锅
（3）台式离心机
（4）多道可调加样器
（5）离心管
（三）质量控制
1、对照血清
每块96 孔板上均需要设立阳性对照和阴性对照，同批次的阳性对照结果滴度应保持2 倍以内。
2、红细胞对照
实验可根据红细胞对照来判断反应时间，尽可能在每块96 孔板上设计一孔红细胞对照（PBS＋1%红细胞悬液）。
3、病毒回滴
一个红细胞凝集单位指能引起等量标准化的红细胞凝集时病毒的量。进行红细胞凝集抑制试验时一般用4 个红细胞凝集单位（指25μL 体积中含有4 个红细胞凝集单位）的病毒量。
（四）实验步骤
1．血清处理
（1）用单道加样器吸出1 体积血清置于无菌Eppendorf 管内，换滴头加入4体积RDE，吹打混匀。
（2）置37℃水浴16～18h。
（3）从37℃水浴取出后置56℃水浴30min 灭活。
（4）马红细胞吸附：瞬时离心，待冷却后加入清洗后的浓红细胞达20%（每100μLRDE 处理过的血清加入20μL 清洗后的浓红细胞）。混匀后室温吸附1 h。
（5）2000rpm 离心5min。
（6）小心吸取上清液至干净离心管中备用。如不需立即检测可放4℃保存。
2．马红细胞的采集及1%马红细胞悬液的配备
（1）在注射器里放入一定体积的阿氏液，从颈静脉处采集马血后放入容器中，轻柔混匀，如阿氏液不足则需补足（阿氏液和红细胞的比例为1：1）。
（2）采集的马红细胞应放入冰箱4℃保存，越新鲜越好，建议在采集后72小时内使用。
（3）在配置1%马红细胞悬液前需清洗红细胞液。首先加入5mL 红细胞（沉积在容器底部的红细胞）至50mL 离心管。加入45mL PBS-0.5% BSA 使总体积达到50mL，轻柔混匀。
（4）2000rpm（600×g） 离心5 min。
（5）吸掉上清液后，连续重复步骤（3）-（4）两次。
（6）为了精准马血球的浓度，取浓缩后的马血球1ml 于1.5ml 离心管中，3600g（8000rpm）离心10min，吸取压缩后血球的上清并统计出吸取上清的体积，计算实际的血球百分比（一般达到未压缩前体积的60-75%）。将完全压缩后的马血球弃去。
