将灭菌的棉拭子插入猪鼻腔,轻轻擦拭3~5次并慢慢旋转,然后取出拭子并放入盛有2mL灭菌的
0.01moL/L pH7.2~7.4 PBS(内含青霉素2000IU/mL,链霉素2mg/mL)管内,加盖、编号,为一个活猪样。
6.1.3禽的相关病毒样品采集
将两个灭菌的棉拭子于 PBS 溶液中浸湿,取一个棉拭子先插入活禽喉头口及上腭裂来回刮 3~5次并慢慢旋转2~3次,取咽喉分泌液;再将另一个棉拭子插入该禽的泄殖腔内1.5cm~2cm轻轻擦拭3~5次并旋转2~3次;将咽喉拭子和泄殖腔棉拭子一起放入盛有1mL灭菌的0.01moL/L pH7.0~7.4 PBS(内含青霉素2000IU/mL,链霉素2mg/mL) 中,加盖、编号,为一个活禽样。小珍禽采咽喉/泄殖腔拭子容易造成伤害,可随机采集 5个新鲜粪便样品,每个样品 1 ~2 g 。
6.1.4 人的相关病毒样品采集
采集被采样人员的咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或气管抽取物、痰等物品。样品不得混合,每个被采样人员的样品需单独检测。
6.1.5 其他动物的相关样品采集
参照6.1.2~6.1.4执行。
6.2 样品的保存和运输
待检样品在2℃~8℃保存不应超过24h;-20℃保存不超过三个月; -80℃以下可长期保存。样品应置于低温、密封的容器内运输。
6.3 样品制备
将采集的样品于旋涡振荡器上振荡混匀约5s后,于离心机中瞬时离心。
7 核酸提取
7.1 核酸抽提(酚氯仿法)
a) 取灭菌的1.5 mL离心管,做好标识。
b) 每管加入600 μL裂解液,分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200 μL,再加入200 μL氯仿,混匀器上振荡混匀5 s,于4℃ 12000 g 离心15 min。
c) 取灭菌的1.5 mL离心管,加入-20℃预冷400 μL异丙醇,吸取本标准6.2各管中的上清液转移至相应的管中,避免吸出中间层,颠倒混匀7.2.4 于4℃ 12000 g离心15 min,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体;加入600 μL 75%预冷乙醇,颠倒洗涤。
d) 于4℃ 12000 g离心10 min,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体。
e) 10000 g离心10 s,用微量加样器将其吸干,室温干燥(5~10)min。
f) 加入15 μL DEPC水,溶解管底的RNA,5000 g离心5s,冰上保存备用,若需长期保存应放置-80℃ 冰箱。