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深圳市市场监督管理局关于发布深圳市标准化指导性技术文件动物甲型H1N1(2009)流感病毒实时荧光RT―PCR检测方法的通知

  将灭菌的棉拭子插入猪鼻腔,轻轻擦拭3~5次并慢慢旋转,然后取出拭子并放入盛有2mL灭菌的
  0.01moL/L pH7.2~7.4 PBS(内含青霉素2000IU/mL,链霉素2mg/mL)管内,加盖、编号,为一个活猪样。
  6.1.3禽的相关病毒样品采集
  将两个灭菌的棉拭子于 PBS 溶液中浸湿,取一个棉拭子先插入活禽喉头口及上腭裂来回刮 3~5次并慢慢旋转2~3次,取咽喉分泌液;再将另一个棉拭子插入该禽的泄殖腔内1.5cm~2cm轻轻擦拭3~5次并旋转2~3次;将咽喉拭子和泄殖腔棉拭子一起放入盛有1mL灭菌的0.01moL/L pH7.0~7.4 PBS(内含青霉素2000IU/mL,链霉素2mg/mL) 中,加盖、编号,为一个活禽样。小珍禽采咽喉/泄殖腔拭子容易造成伤害,可随机采集 5个新鲜粪便样品,每个样品 1 ~2 g 。
  6.1.4 人的相关病毒样品采集
  采集被采样人员的咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或气管抽取物、痰等物品。样品不得混合,每个被采样人员的样品需单独检测。
  6.1.5 其他动物的相关样品采集
  参照6.1.2~6.1.4执行。
  6.2 样品的保存和运输
  待检样品在2℃~8℃保存不应超过24h;-20℃保存不超过三个月; -80℃以下可长期保存。样品应置于低温、密封的容器内运输。
  6.3 样品制备
  将采集的样品于旋涡振荡器上振荡混匀约5s后,于离心机中瞬时离心。

7 核酸提取

  7.1 核酸抽提(酚氯仿法)
  a) 取灭菌的1.5 mL离心管,做好标识。
  b) 每管加入600 μL裂解液,分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200 μL,再加入200 μL氯仿,混匀器上振荡混匀5 s,于4℃ 12000 g 离心15 min。
  c) 取灭菌的1.5 mL离心管,加入-20℃预冷400 μL异丙醇,吸取本标准6.2各管中的上清液转移至相应的管中,避免吸出中间层,颠倒混匀7.2.4 于4℃ 12000 g离心15 min,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体;加入600 μL 75%预冷乙醇,颠倒洗涤。
  d) 于4℃ 12000 g离心10 min,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体。
  e) 10000 g离心10 s,用微量加样器将其吸干,室温干燥(5~10)min。
  f) 加入15 μL DEPC水,溶解管底的RNA,5000 g离心5s,冰上保存备用,若需长期保存应放置-80℃ 冰箱。


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