A4：待检血清标本2，恢复期血清
A5：待检血清标本3，急性期血清
A6：待检血清标本3，恢复期血清
A7：待检血清标本4，急性期血清
A8：待检血清标本4，恢复期血清
A9：A（H1N1）亚型标准抗血清
A10：A（H3N2）亚型标准抗血清
A11：B型Yamagata系标准抗血清
A12：B型Victoria系标准抗血清
（4）用多道加样器从A行各孔分别吸取25μl血清，由A行至H行进行2倍稀释血清，弃去H行最后25μl；
（5）红细胞凝集抑制试验板：每孔加入25μl新配制的4个血凝单位抗原，
血清对照板每孔加入25μlPBS；
（6）轻轻弹击微量板，使抗原与抗体充分混合；
（7）室温孵育15分钟；
（8）每孔加入50μl红细胞悬液，混匀；
（9）室温孵育30～60分钟；
（10）观察红细胞凝集抑制试验结果，对照板应不出现凝集。
二、红血球吸附实验（HAd）
（一）生物安全要求
操作应在二级生物安全柜中进行。
（二）实验材料
0.5%豚鼠血球
倒置显微镜
1、每支MDCK，LLC-MK2中加入100ul0.5%豚鼠血球细胞。
4℃下放置30分钟。
在光学显微镜下观察结果：
阳性----RBCs呈簇状成团被吸附在细胞上或者飘浮在培养液中
阴性--- 单个RBCs散状飘浮。
如果结果呈阳性，进行IF实验。
8.4 IF实验6．免疫荧光实验
7．胶体金实验
8．荧光RT－PCR检测
8.4.1制备细胞涂片
（1）当细胞出现CPE时，将培养液存放在无菌的保存管中以备其他的实验（如果已经做了HAd实验为了防止留在管中的RBCs对HA/HAI实验有影响，应当将培养液冻融，使红细胞破裂）
（2）用PBS将管中留下的细胞层洗3次.
（3）刮取细胞，并将混浊的细胞悬液滴加在干净玻片的小孔上
（4）当疑似是流感CPE时应当做4个孔：2孔作A，B型流感鉴定，2孔做H1，H3亚型鉴定.当HAd阳性或者出现疑似副流感2型的CPE时应当做7个孔： 2孔作A，B型流感鉴定，2孔做H1，H3型鉴定，三孔分别做副流感1，2，3型鉴定.如果HAd实验阳性，但是IF实验阴性，需要再做副流感4型IF.
（5）烘干并用丙酮固定10分钟。
8.4.2直接IF法
（1）每孔加入10ul相应的单克隆抗体-FITC结合物（流感A，流感B，副流感1，2，3或4），并涂匀（试剂用完后要及时放回冰箱）。
（2）将玻片放在垫有湿纸巾的盒子中，在37℃放置15分钟（流感A，流感B，副流感1，2，3）或者30分钟（副流感4）。
备注：不能让孔中的液体干，否则会引起非特异性的结果。
（3）用PBS轻轻的冲洗抗原片，并将其浸泡在装有PBS的杯中缓慢振摇5分钟。
（4）烘干或者用纸巾轻轻蘸干。
（5）每孔滴加一滴mountant盖上盖玻片在荧光显微镜下用低倍镜观察。
（6）如果不能及时的看片，应当将抗原片避光2-8℃保存，尽量在24小时之内看片。
（7）所有的结果应当有另一人复核。
8.4.3间接IF法
（1） 每孔加入10ul相应的单克隆抗体 （A型流感H1，H3， H5亚型），并涂匀（试剂用完后要及时放回冰箱）。
（2）将玻片放在垫有湿纸巾的盒子中，在37℃放置30分钟。
备注：不能让孔中的液体干，否则会引起非特异性的结果。
（3）用PBS轻轻的冲洗抗原片，并将其浸泡在装有PBS的杯中缓慢振摇5分钟，并重复一次。
（4）烘干或者用纸巾轻轻蘸干。
（5） 每孔加入10ul anti-mouse-FITC结合物，涂匀。
（6）重复步骤（2）至（4）。
（7）每孔滴加一滴mountant盖上盖玻片在荧光显微镜下用低倍镜观察。
（8）如果不能及时的看片，应当将抗原片避光2-8℃保存，尽量在24小时之内看片。
（9）所有的结果应当有另一人复核。
三、免疫荧光方法检测流感病毒
（一）原理
流感病毒主要感染呼吸道上皮细胞，因此在病人呼吸道标本的脱落细胞中含有流感病毒抗原，通过直接检查上皮细胞内病毒特异性抗原即可诊断。
（二）标本处理
标本采集最好用负压抽取法收集的呼吸道分泌物。
1. 在标本中加入维持培养液至总体积为4 ml。
2. 使用吸管吹打悬浮液数次。
3. 2000 rpm离心5分钟。
4. 保留上清液做培养。
5 用10 ml pH7.2 PBS清洗细胞沉淀，弃上清。
6. 用0.5 ml pH7.2 PBS 重新悬起沉淀。
（三）间接免疫荧光法
1. 在特富龙涂层的12孔显微载玻片的每个孔上加入10 µl细胞悬浮液。
2. 用载玻片干燥器干燥载玻片或室温自然干燥。
3. 用100 ％冰丙酮室温10分钟固定载玻片。
4. 室温晾干载玻片。
5. 每孔加10 µl 流感相应亚型的特异性抗体（1：1000）
6. 玻片在湿盒中37 ℃放置45分钟。
7．pH7.2 PBS洗涤1分钟。
8. 室温晾干载玻片。
9. 每孔加入10 µl 1：20 兔抗鼠荧光素结合物（二抗），及0.1 % 伊纹氏蓝（Evans Blue）做负染。
10.玻片在湿盒中37 ℃放置45分钟。
11.pH7.2 PBS洗涤1分钟。
12.室温晾干载玻片。
13.加上盖玻片，加上甘油。
14．在400X 荧光显微镜镜下检查。
（四）结果判断
阳性讯号为细胞质内苹果绿色荧光，阴性细胞显示为深红色的细胞质部分。观察到三个以上荧光阳性即可判为阳性。
四、流感/人禽流感实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测
一、基本原理
实时荧光定量（Real-time ）RT-PCR术，是指在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个RT-PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法。
（一）荧光基团主要有TaqMan荧光探针和SYBR荧光染料
1．TaqMan荧光探针：PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号可被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将与PCR产物杂交形成双链的探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
2．SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入双链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
（二）相关的几个概念
1．Ct值：C代表CyCle，t代表threshold。Ct值是指反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数 。
（2）阈值（threshold）：PCR反应前15个循环荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是6～15个循环荧光信号标准偏差的10倍。
3．基线（baseline）：指PCR反应指数扩增前平均本底荧光信号值，通常取6～15个循环的平均荧光信号值。
4．Ct值与起始模板的关系：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
二、实验试剂
1．引物：A型流感通用引物、H5、H7、H9分型引物
2．RT-PCR酶
3．RT-PCR反应液
4．Taq酶
5．无RNA酶的水
6．阳性对照（非感染性体外转录RNA）
7．阴性对照
8．无RNA酶的水
三、实验步骤
（一）核酸提取
方法同RT-PCR的快速诊断。
（二）RT-PCR反应体系配置
1．配置反应体系
从试剂盒中取出相应的 RT-PCR反应液、Taq酶，反应液在室温下融化后，2000rpm离心5秒钟。设所需PCR数为n（n ＝ 样本数 ＋ 1管阴性对照 ＋ 1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：
试剂
| RT-PCR反应液
| Taq酶
|
用量
| 9.8μl
| 0.2μl
|
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入n/2颗RT～PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装10μl。
2．加模板
在各设定的PCR管中分别加入RNA溶液各10μl，盖紧管盖，放入荧光 PCR荧光检测仪内，记录样本摆放顺序。
（三）RT-PCR反应
1．循环条件设置
程序
| 循环数
| 温 度（摄氏度）
| 反应时间（分钟：秒）
|
1
| 1
| 42
| 30：00
|
2
| 1
| 92
| 3：00
|
3
| 5
| 92
| 10
|
45
| 30
|
72
| 1：00
|
4
| 40
| 92
| 10
|
60
| 30
|
5
| 1
| 40
| 0
|
2．仪器检测通道选择F1通道。
（1）结果分析条件设定
读取F1通道的检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。
（2）质控标准
阴性对照的检测结果为阴性。
阳性对照的Ct值应小于等于28.0。
否则，此次实验视为无效。
（四）结果判断
（1）Ct值无数值的样本为阴性样本。
（2）Ct值≤30.0的样本为阳性。
（3）Ct值大于30.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。
（五）问题解决
1．若阴性对照出现扩增，可以考虑由于环境污染而造成的假阳性。此时应设立空白对照检测：在实验当天取一盛有500μl纯水的1.5ml离心管置于工作台，并于实验结束后作为待检样品检测，检测结果应为阴性。若出现阳性则说明发生环境污染，此时应对室内进行通风、擦洗工作台及实验用品，并对实验用离心管、吸头重新高压灭菌，更换所有自备试剂。
2．阳性对照Ct值大于30，则应考虑RNA降解，此时应对实验用离心管、吸头重新高压灭菌，并严格按操作流程进行实验。
五、快速诊断试剂盒*
流感快速诊断试剂盒可以用于暴发疫情标本的快速检测，目前全世界有10种市场化的流感快速诊断试剂盒，其中9种为检测流感病毒的NP抗原，1种检测流感病毒的NA抗原。快速诊断试剂盒的优点是：能在30分钟内提供快速诊断试验结果；能够帮助检测流感爆发；可以在临床中使用；适用于多种情况，操作简便。但是这些试剂盒的缺点是：比病毒培养或RT-PCT准确性要低；有一些诊断试验不能区分甲型和乙型流感病毒的感染；没有诊断试验能区分甲型流感病毒的各亚型；没有毒株、分子生物学和抗原特征的信息。各种诊断试剂盒的使用参照试剂盒说明书。
现有的试剂盒可以分为以下三类：
1. 只检测甲型流感病毒
·Directigen Flu A
2. ·检测和区分甲型和乙型流感病毒Directigen Flu A ＋ B； FLU OIA A/B FLU OIA A/XPECT FLU A/B； NOW FLU A/B
Flu A .B； B； Influ B Quick
3. ·检测但不能区分甲型和乙型流感病毒QuickVue Influenza Test
FLU OIA ZstatFlu
六、免疫荧光实验（IF）
（一）检测样本
病人呼吸道标本的脱落细胞，或培养一周后CPE不明显但HAd为阳性的细胞培养物。
（二）实验步骤
1． 制备细胞涂片
（1）病人的呼吸道标本
最好采集用负压抽取法收集的呼吸道分泌物作为检测样本。
① 在标本中加入维持培养液至总体积为4 ml。
② 使用吸管吹打悬浮液数次。
③ 2000 rpm离心5分钟。
④ 保留上清液做培养。
⑤ 用10 ml pH7.2 PBS清洗细胞沉淀，弃上清。
⑥ 用0.5 ml pH7.2 PBS 重新悬起沉淀。
⑦将混浊的细胞悬液滴加在干净玻片的小孔上
⑧ 每个样本需要做两个孔进行A，B型流感鉴定。
⑨ 烘干并用丙酮固定10分钟。
（2）细胞培养物①当细胞出现CPE时，将培养液存放在无菌的保存管中以备其他的实验（如果已经做了HAd实验为了防止留在管中的RBCs对HA/HAI实验有影响，应当将培养液冻融，使红细胞破裂）
②用PBS将管中留下的细胞层洗3次。
③刮取细胞，并将混浊的细胞悬液滴加在干净玻片的小孔上
④每个样本需要做两个孔进行A，B型流感鉴定。
⑤烘干并用丙酮固定10分钟。
2直接IF法
（10）每孔加入10ul相应的单克隆抗体-FITC结合物，并涂匀（试剂用完后要及时放回冰箱）。
（11）将玻片放在垫有湿纸巾的盒子中，在37℃放置15分钟。
备注：不能让孔中的液体干，否则会引起非特异性的结果。
（12）用PBS轻轻的冲洗抗原片，并将其浸泡在装有PBS的杯中缓慢振摇5分钟。
（13）烘干或者用纸巾轻轻蘸干。
（14）每孔滴加一滴mountant盖上盖玻片在荧光显微镜下用低倍镜观察。
（15）如果不能及时的看片，应当将抗原片避光2-8℃保存，尽量在24小时之内看片。
（16）所有的结果应当有另一人复核。
3间接IF法
（1） 每孔加入10ul相应的单克隆抗体，并涂匀（试剂用完后要及时放回冰箱）。
（2）将玻片放在垫有湿纸巾的盒子中，在37℃放置30分钟。
备注：不能让孔中的液体干，否则会引起非特异性的结果。
（3）用PBS轻轻的冲洗抗原片，并将其浸泡在装有PBS的杯中缓慢振摇5分钟，并重复一次。
（4）烘干或者用纸巾轻轻蘸干。
（5） 每孔加入10ul anti-mouse-FITC结合物，涂匀。
（6）重复步骤（2）至（4）。
（7）每孔滴加一滴mountant盖上盖玻片在荧光显微镜下用低倍镜观察。
（17）如果不能及时的看片，应当将抗原片避光2-8℃保存，尽量在24小时之内看片。
（18）所有的结果应当有另一人复核。
（三）结果判断
阳性讯号为细胞质内苹果绿色荧光，阴性细胞显示为深红色的细胞质部分。
七、胶体金实验
（一）适用范围
本检测细则适用于用创新科技生产的凯必利甲型乙型流行性感冒病毒胶体金法快速诊断试剂盒对鼻腔抽吸液、鼻腔擦拭液和咽喉擦拭液标本中甲型乙型流感病毒进行定性测定。
（二）检测项目及参数：
甲型流感病毒检测试剂盒的最小检测灵敏度是：3.0×104TCID50/每次检测。
乙型流感病毒检测试剂盒的最小检测灵敏度是：1.5×105TCID50/每次检测。
（三）样本采集：
1鼻腔抽吸液的采集方法：
抽吸器一侧的管子连接在抽吸泵上，另一侧的管子从外鼻孔完全插入鼻腔。启动抽吸泵采集鼻腔液在抽吸器中。
2鼻腔擦拭液的采集方法：
将灭菌的棉棒完全插入鼻腔中，摩擦鼻甲数次，采集粘膜表皮。
3咽喉擦拭液的采集方法：
将灭菌的棉棒从口腔完全插入咽喉中，以咽喉壁、上颚扁桃的发红部位为中心，摩擦数次，采集粘膜表皮。采集时，要注意不要触碰到唾液。
备注：①采集的样本应当尽早按照下述调制的方法进行样本处理。
②因去除细胞成分会降低灵敏度，所以在进行样本测试前，勿离心分离。
③所有的样本都应视作具传染性，操作时应做好防护。
（四）操作方法：
1样本的前处理：
（1）鼻腔抽吸液
将鼻腔抽吸液0.5ml悬浊于运输培养基或2ml生理盐水中。在已经加入了样本抽提液的抽提用管子中加入0.5ml悬浊液（到上方的基线为止），充分混和后作为样本待测。
（2）鼻腔擦拭液和咽喉擦拭液
将采集了样本的棉棒浸在抽提用管子中的样本抽提液中，并搅拌。从抽提用管子的外侧，用手指挤压灭菌棉棒数次，使样本抽提液充分浸透棉棒，然后取出棉棒，绞出的液体作为样本待测。
2检测方法
（1）将附属的喷嘴插入抽提用管子上端。
（2）捏紧抽提用管子，使样本滴下3滴到检测板的样品滴下部。
（3）15分钟后观察检测板的判定部。按如下方法进行判定。
（五）结果判定：
根据操作方法使其发生反应，结合C位及T位显示紫红色条带的情况进行判定。
（1）阳性：图略
（2）阴性：图略
（3）再检测：图略
不要在15分钟之内判定结果。超过了判定时间的检测板，因干燥等原因，有时结果会发生变化。请在样本滴下后60分钟以内进行判定，超过60分钟时，请用别的检测板重试。当C位无紫红色的条带出现，可认为是测定操作上出现问题，应当请用别的检测板重试。
（六）注意事项：
（1）该试剂盒是用于快速检测试剂，还需结合临床症状、病毒的分离培养及其他的检测结果综合判断进行确诊。
（2）试剂盒应存放在2－30℃中，避免高温潮湿及阳光直射。
（3）使用前，不能打开装有检测板的铝箔袋。
（4）勿用手直接接触检测板的样本滴下部及判定部。
（5）在使用附属的棉棒时，待样本抽提后，应迅速拔去棉棒，因其长时间浸泡中心轴会吸水。
（6）因棉棒是纸做的，在操作时应当小心操作以防断裂。
（7）对于很粘稠会堵塞过滤网的样本，请用样本抽提液稀释后再使用。
（8）测定使用过的检测板、灭菌棉棒、抽提用管子、喷嘴、残余样本应视为传染性物质，应按照相关要求处理。
（9）样本抽提液中含有0.09％的作用防腐剂的叠氮化钠。含有叠氮化钠的液体长期废弃在金属的排水管中，有时会生成有爆炸性的叠氮化物，所以废弃时应当用大量的水一起排出。
（七）支持性文件：
创新科技凯必利甲型乙型流行性感冒病毒胶体金法快速诊断试剂盒说明书。
八、H5亚型荧光RT－PCR检测
（一）适用范围
本检测细则适用于进行H5亚型荧光RT-PCR检测。
（二）参数
最低检测极限为10-6TCID50。
（三）检测仪器设备
Roche Lightcycler荧光PCR检测仪。
（四）样本处理及试剂配套
1样品种类
（1）咽拭子、鼻拭子
（2）咽漱液
（3）呼吸道标本（适用于气管插管病人）
（4）痰液标本
（5）血液标本
（6）尸检组织标本
2．样品存放
制备号的样品在2℃∽8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存置-70℃以下，但因避免反复冻溶（冻溶不超过3次）
3．最少样品量：100ul
4．试剂及配套品：
试剂：深圳匹基试剂
最少样品量：50ul
试剂及配套品：
试剂1：抽提RNA试剂，-20℃预冷。
试剂2：样本处理试剂，4℃保存，6个月有效。
试剂3：RT-PCR试剂，RT-PCR酶在室温下置于干燥器内保存，其它试剂-20℃保存。
标准品：-20℃保存。
（五）操作方法
1样品处理（样品处理区进行）
（1） 取n个灭菌的1.5mLEppendorf管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和（阴性对照和阳性对照在试剂盒中已标出），编号。
（2） 每管加入600uL裂解液、分别加入被检样本、阳性对照、阴性对照各200uL，一份样本换用一个吸头，再加入200uL氯仿，混匀器上振荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀）。于4℃、12000r/min离心15min。
（3） 取与8.1.1相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管，加入500uL异丙醇（-20℃预冷），做标记。吸取本标准8.1.2各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500uL，不能吸出中间层，颠倒混匀。
（4）于4℃、12000r/min离心15min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品需在吸水纸不同地方沾干）；加入600uL75％乙醇，颠倒洗涤。
（5）于4℃、12000r/min离心10min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品需在吸水纸不同地方沾干）。
（6） 4000r/min离心10s（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残留液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀的一面，室温干燥3min，不能过于干燥，以免RNA不溶。
（7） 加入11uLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA需在2h内进行PCR扩增；若需长期保存须放置-70℃冰箱。
2．扩增试剂准备（PCR前准备区）
从试剂盒中取出荧光RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后稍离心。
设所需要的PCR管数为n，其中n为被检样品、阳性对照和阴性对照的和每个样品测试反应体系配制如下表：
试剂
| RT-PCR反应液
| Taq酶
|
用量
| 15ul
| 0.25ul
|
根据检测样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积试管中，向其中加入0.25/n颗RT-PCR反逆转录酶颗粒，充分混合均匀后，向每个荧光RT-PCR管中各分装15ul，转移至样本处理区。
3．加样（样本处理区）
在所设定的n个PCR薄壁管中分别加入步骤1中处理过的样本、阴性对照、阳性对照各10ul，盖紧管盖，将PCR薄壁管放在离心机中，于4000rpm离心5sec，转移至检测区，置于iCycler PCR仪上并记录样本摆放顺序。
4． PCR扩增（检测区）
循环条件设置
第一阶段：反转录42℃/30min；
第二阶段：预变性92℃/3min；
第三阶段：92℃/10s，45℃/30s，72℃/60s，5个循环；
第四阶段：92℃/10s，60℃/30s，40个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。实验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
（六）结果判定
1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增线的最高点为准。
2质控标准
（1）阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。
（2）阳性对照的Ct值应＜28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
3结果描述及判定
（1）阴性
无Ct值并且无扩增曲线，表示样品中无禽流感病毒
（2）阳性
Ct值≤30，并出现典型的扩增曲线，表示样品中存在禽流感病毒。
（3）有效原则
Ct＞30的样本建议重做。重做的结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。
（七）支持性文件
《禽流感病毒H5荧光RT-PCR检测方法操作说明书》
《禽流感病毒H5荧光RT-PCR检测方法GB/T19438.1-2004》
附件6
流感爆发疫情样本指引
（一）标本采集
由当地疾控中心流病科人员负责采集发病3天内且没有服用过抗病毒药物的疑似流感病例的鼻咽拭子或咽漱液。采集人员需填写“流感/人禽流感监测病例标本原始登记送检表”，并将标本在4℃保存下，24小时之内送到实验室，未能24小时内送至实验室的，应置-70℃或以下保存。
（二）实验室检测
流感样病例暴发疫情中常用的检测方法有流感快速诊断试剂盒检测、RT－PCR检测和病毒分离培养。其中流感快速检测和RT－PCR检测可用于早期、快速的实验室检测。无论是否进行流感快速诊断试剂盒检测和RT－PCR检测，都应进行常规的流感病毒分离鉴定。尤其是流感快速检测和RT－PCR检测阳性的标本，应尽量分离到流感病毒。
1.RT－PCR法检测病毒核酸
RT－PCR法是检测流感病毒核酸的方法，能检测出非常低水平的流感病毒的核酸，不管病毒是否具有活性均可进行测定。可选择区分流感病毒的A型通用引物、B型引物同时进行试验，具体方法见附件 。
2.流感快速诊断试剂盒检测
流感快速诊断试剂盒可检测流感病毒的NP抗原和M1抗原，用于暴发疫情中病例咽、鼻拭子或含漱液标本的快速检测。可在30分钟内提供检测结果，初步判断疫情性质，可在现场中使用，操作简便，具体方法见附件 。
但是这种快速检测比病毒分离培养或RT-PCR的敏感性低，无法确定流感病毒的亚型，结果只能用作参考。
3.病毒分离鉴定
病毒分离鉴定是流感实验室诊断中最常用、高度敏感、最准确的方法之一，所分离到的病毒可长期保存，并进行抗原性分析。因此在暴发疫情中，常规用于实验室检测，具体内容同流感样病例的病原学监测。
附件7
流感实验室检测工作指引
一、流感检测实验室生物安全规定：
（一） 流感检测实验室的生物安全基本原则：
（二） 实验室的相关生物安全管理规定：
（三） 建立实验室人员准入制度：
（四） 实验室实行分级、分区管理
（五） 良好的微生物学技术操作规范
（六） 实验室废弃物处理规定
（七） 意外事故处理办法（记录、报告）及应急预案
（八） 实验室消毒和灭菌
（九）流感实验室检测中应注意的问题
二、禽流感职业暴露人员防护要求
1.防护用品
2.防护用品的穿脱顺序
3.分级防护原则
4.对手清洗和消毒的要求和方法
三、流感样标本的采集、运送、接受、及处理
（一）采样准备
（二）采样方法
（三）标本的运送
（四）标本的接收
（五）标本的处理
四、流感病毒的病原学监测
（一）样本采集
（二）样本的接收
（三）病毒的分离培养
（四）病毒的鉴定
五、流感暴发疫情样本的检测
（一）标本采集
（二）实验室检测
1.RT－PCR法检测病毒核酸
2.流感快速诊断试剂盒检测
3.病毒分离鉴定
六、毒株的鉴定及上送
对各区监测实验室上送的及本实验室的血凝阳性标本，应于2周内用HI实验进行流感病毒的型别鉴定。经初步鉴定后全部上送国家流感中心及广东省疾病预防控制中心进行确证。
（一）流感毒株的送检要求
1.流感样病例监测哨点医院采样，所分离到的流感病毒，HA≥1：8；
2.暴发疫情采样分离到的所有毒株；
3.认真填写流感/人禽流感毒株送检单各项内容；
4.所送检的毒株要求每份3ml，并且无细菌污染。
（二）寄送流感毒株标本的包装、运输
1.病毒标本必须放在大小适合的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里，拧紧。盖上盖子后不应有泄漏，推荐使用螺口细胞保存管保存和运输流感病毒标本；
2.将密闭后的病毒标本放入大小适合的塑料袋内密封；
3.直接在塑料管上用油性记号笔写明病毒的名称，同时也将病毒标本有关信息填写在送检单内，送检单应单独放在防水的袋子里；
4.将装标本的密封袋放入专用运输箱内（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具防水和缓冲能力的材料。
（三）毒株的保存管理
