（4）手消毒的方法
手消毒可用0.3-0.5%碘伏消毒液或快速手消毒剂（异丙醇类、洗必泰-醇、新洁尔灭-醇、75%酒精等消毒剂）揉搓作用1-3分钟。
附件3
流感监测临床标本的采集、运送、处理及流感病毒株的运输指引
（一）流感临床标本的采集
病毒分离成功与否很大程度上取决于临床标本的质量，及其保存运输等环节。多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织。标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存。
采样液常用的采样液有以下五种：普通肉汤、pH7.4～7.6的Hank''s、Eagle''s、水解乳蛋白液或不加抗菌素的生理盐水（漱喉液）。为防止采样液生长细菌和真菌，在采样液中需加入抗菌素，加入庆大霉素，其终浓度为0.1mg/ml，和抗真菌药物，其终浓度为2mg/ml。加入抗菌素以后重新调节pH值为7.4，配制好以后，分装每个采样管4ml，-20℃冻存。采样方法有以下几种：
1） 鼻拭子：将带有聚丙烯纤维头的拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以另一拭子拭另侧鼻孔。将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。
2） 咽拭子：用带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。 注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。
3） 鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液5ml涮洗收集器3次。
4） 漱口液：用10 ml生理盐水漱喉。漱时让患者头部微后仰，发“噢”声，让生理盐水在咽部转动。然后，用平皿或烧杯收集洗液
5） 鼻洗液：患者取坐姿，头微后仰，用移液管将5 ml生理盐水注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使生理盐水流出，用平皿或烧杯收集洗液。重复此过程洗两侧鼻孔。
（二）临床标本运送
新鲜的临床采集标本应在4℃条件下24小时内运送至全国流感监测网络实验室。未能24小时内送至实验室的，应置-70℃或以下保存。标本送至实验室后，病毒分离标本应尽快进行接种分离，24小时内能进行接种的可置于4℃保存，如未能接种应置-70℃或以下保存。
冻存的临床采集标本应在冻存的条件下，低温送至实验室。冻存的标本送到实验室后，24小时内能进行病毒分离的，可以放置4℃保存。如未能分离的标本应置-70℃或以下保存。
临床标本采集管建议使用带螺口的塑料管。
（三）临床标本处理
临床采集标本送至实验室后，须经处理后再进行病毒的分离接种。含聚丙烯纤维的拭子的采集标本，先将含聚丙烯纤维的拭子在管壁反复挤压后取出。鼻腔或咽部洗液的标本，充分振荡标本管，将粘液打碎。置4℃待其自然沉淀5～10分钟，取上清5 ml。上清液可直接接种或低温保存。
鼻咽漱液或抽取液：用干净灭菌过的毛细吸管，在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液，同样置4℃待其自然沉淀5～10分钟，取上清5 ml。上清液可直接接种或低温保存。
注：如采样液中尚未加抗菌素，应在接种前补加，用量同上前，混匀后置4℃ 过夜或室温作用数小时后可接种。
临床标本处理后，将原始标本分为三份，一份（40％）用于鸡胚接种，一份（30％）用于MDCK细胞接种，一份（30％）保存待复核用。对于病毒分离阳性的标本－70℃保存6个月，在收到国家流感中心复核鉴定报告后，按照生物安全有关规定处理；病毒分离阴性的标本随时按生物安全的有关规定处理。
（四）血清标本的采集与处理
血清标本多用于流感暴发时的血清学核实诊断及人禽流感待查病例的诊断。血清标本采集应该包括急性期和恢复期双份血清。急性期血样应尽早采集，可在采集病毒分离标本时同时采集，但不能晚于发病后7天。恢复期血样则在发病后2～4周采集。一般采集空腹血。单份血清不能用作诊断。
取一根至少能装3 ml以上，干净和灭过菌的血清管做好标记，并进行登记，登记的内容包括：医院名称，患者姓名，性别，急性期（Acute，A）或是恢复期（Convalescence，C），采样日期（年，月，日）。
1． 从患者手臂静脉采2 ml血，放入准备好的上述血清管中。
2． 然后置室温数小时待血完全凝固。
3． 1500～2000rpm离心10分钟，收集血清于1.5 ml 无菌管中，做好标记。
4． 血清可置4℃存放一周，存放超过一周需置-20℃或以下保存。
（五）流感病毒株的运输
需送国家流感中心实验室检测的病毒分离物，填写“流感/人禽流感毒株送检单”，在冻存后，在低温条件下，送至中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所流感中心进行复核，运输时遵守国家生物安全的有关规定。
1．流感毒株的送检要求
（1）自国家级流感样病例监测哨点医院采样，所分离到的全部毒株。
（2）自其它流感样病例监测哨点医院采样，所分离到的流感病毒，单向血凝抑制效价与国家流感中心提供的标准参照血清相比，有4倍或4倍以上差异的毒株。
（3）自其它流感样病例监测哨点医院采样，所分离到的流感病毒，HA＜8，且网络实验室不具备RT-PCR鉴定能力。
（4）暴发时采样分离到的所有流感毒株。
（5）HA阳性，用国家流感中心提供的标准参照血清进行HI试验，4种血清的HI效价均≤20的毒株。
（6）所送检的毒株要求每份3ml，并且无细菌污染。
（7）全国流感监测网络实验室直接将毒株送至国家流感中心，填写“流感/人禽流感毒株送检单”。监测网络实验室中的市级实验室送检毒株时，应同时送省级疾控中心实验室备份。
（8）送检毒株在HI试验完成后，每两周送至国家流感中心。
（9）HA阳性，用国家流感中心提供的标准参照血清进行HI试验，4种血清的HI效价均≤20的毒株，应在HI试验完成后24小时内送至国家流感中心。
2．寄送流感中心的流感毒株标本的包装、运输
（1）病毒标本必须放在大小适合的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里，拧紧。盖上盖子后不应有泄漏，推荐使用螺口细胞保存管保存和运输流感病毒标本。
（2）将密闭后的病毒标本放入大小适合的塑料袋内密封。
（3）直接在塑料管上用油性记号笔写明病毒的名称，同时也将病毒标本有关信息填在“流感/人禽流感毒株送检单”内，送检单应单独放在防水的袋子里。
（4）将装标本的密封袋放入专用运输箱内（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。
（5）标本运输：异地运输可以采用邮寄或快递的方法
（六）标本的接收
送检的标本（毒株）送到实验室后，由专人在生物安全柜内打开标本的包装。记录收到日期、送检实验室名称、核对并记录送检标本（毒株）标编号是否与送检单相同。收到的毒株后，给送检单位及时反馈。
附件4
流感病毒培养分离技术指引
病毒分离是流感诊断的金标准，也是流感病原学监测的基础。目前，常用鸡胚和MDCK（狗肾细胞）分离培养流感病毒。
一、流感病毒鸡胚分离标准操作规程
1.试验材料：
（1）9～11日龄鸡胚
（2）照卵灯
（3）70%～75％酒精
（4）一次性注射器
（5）鸡蛋开孔器
（6）蜡或胶水
（7）10ml 试管和试管架
（8）1、2、5、10ml 移液管
（9）无菌镊子
2.流感病毒鸡胚分离程序
所有有关病毒分离的操作都应在生物安全Ⅱ实验室生物安全柜中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定。进入生物安全Ⅱ实验室要求遵循生物安全实验室的个人防护要求。
（1）验卵
1） 用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎的位置；
2） 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉；
3） 如何判断鸡胚状态
血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块
胎动：活胚有明显的自然运动，但是大于14天的胎动则不明显；死胚无胎动
绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限。
（2）鸡胚接种
1） 将鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个鸡胚，通常每个样本接种3个鸡胚；
2） 用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10x6mm裂口，每份标本接种3个鸡胚；
3） 用注射器吸200µl处理过的临床标本，装上16 号针头；
4） 从裂口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层（脏层）铺开，此时在照卵灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射100µl临床标本。将针头退出至½ 寸，将另外100 µl临床标本注入鸡胚尿囊腔；
5） 用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚；
6） 将针头弃于合适的生物安全装置中；
7） 用消毒过的医用胶布封口；
8） 33～35℃ 温箱培养鸡胚2～3 天。A型流感病毒培养2天，B型流感病毒培养3天，临床采样标本通常培养3天；鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去；
提示：禽流感需35ºC 或 37℃培养，哺乳动物流感病毒35℃培养（禽流感在35ºC时也会生长良好！）
（3）鸡胚尿囊液和羊水的收获
1） 鸡胚在收获前应4℃过夜或至少放置4小时；
2）标记15ml 无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致。用70%～75％酒精消毒鸡胚顶部；
3）用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜，用10ml 吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中；用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中，羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并；
4）将鸡胚收获液3000rpm离心5分钟去除血液和细胞，进行红细胞凝集试验（具体方法参见流感病毒的鉴定技术中的HA试验部分），HA≥8 的进行病毒的鉴定；如没有红细胞凝集现象的标本，应再进行鸡胚传代1次（对于“O”相的毒株，需要连续传代多次才能具备在鸡胚中生长的特性）；传代后HA滴度仍为阴性的标本，可以按有关生物安全规定进行处理；对于HA≤8 的鸡胚分离物继续进行鸡胚传代，直至HA≥8 时再进行病毒的鉴定；经连续传代后HA＜8，可以用RT-PCR方法鉴定分型；
5）对于HA≥8的病毒进行鸡胚病毒传代前应将病毒液进行10-1…10-3稀释，具体的稀释浓度与HA滴度的大小有关，一般滴度小于32时选择10-1稀释度接种；滴度大于32以上时选择10-2或10-3稀释度接种。
（四）注意事项
1．不要在-20℃条件下保存病毒分离物，因为该温度条件下流感病毒极不稳定；
2．流感病毒分离操作严格按照生物安全规程的要求。禁止在同一实验室，同一时间处理接种未知临床标本和已知标准病毒；禁止在同一实验室，同一时间处理接种采自不同动物的标本；动物标本（如猪、禽等）必须与人的标本分别保存。
二、MDCK细胞培养技术
（一）生物安全级别和生物安全规定
1．MDCK细胞培养实验室生物安全级别：生物安全一级或以上；
2．实验室生物安全规定
遵守生物安全实验室相应的生物安全规定。
（二）细胞培养的所需材料：
1．生长成片的MDCK细胞；
2．T-75细胞培养瓶， 颈口有倾角；
3．D-MEM培养液；
4．青、链霉素母液（10，000 U/ml 青霉素 G；10，000 µg/ml 硫酸链霉素），分装后保存于-20 ℃；
5．HEPES 缓冲液， 1 M 母液；
6．胎牛血清，40 nm滤过；
7．EDTA-胰酶 （0.05% 胰酶；0.53 mM EDTA . 4Na），分装后保存于-20 ℃；
8．牛血清白蛋白组分V， 7.5%溶液；
9．1ml 、10ml无菌移液管；
10．70％～75％的酒精；
建议：要求经常检查试剂使用的有效期。
（三）培养基和试剂的准备
1. 含L-谷氨酸的完全型D-MEM培养液的准备（用于MDCK培养）：
500 ml D-MEM液中加入：
青、链霉素母液5 ml （终浓度达： 100 U/ml 青霉素and 100 µg/ml 链霉素）
HEPES缓冲液12.5 ml （终浓度： 25 mM）
7.5%牛血清白蛋白组分V 12.5 ml ；
2. 细胞生长液
胎牛血清5 ml 加到 95 ml 的完全型D-MEM液使胎牛血清的终浓度为5%。
注：此处采用进口特级胎牛血清，因此牛血清的终浓度选则5％。
3. MDCK细胞的培养程序
这里以T-75细胞瓶单层培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的浓度必须做相应的调整。用于细胞培养的培养基、EDTA－胰酶等，37 ℃回温后，用70％～75％酒精擦拭后放于生物安全柜内。
（1）弃培养液，加5 ml预先37℃温浴的EDTA-胰酶；
（2）温和地摇动细胞瓶1分钟，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA-胰酶；
（3）重新加入5 ml预先37℃温浴的EDTA-胰酶重复上述步骤；
（4）加1 mlEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料表面分离（约5～10分钟）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。加入1ml牛血清灭活残余的胰酶；
（4）加9 ml完全型D-MEM，轻轻上下移动移液管来分散细胞团；
（5）取10 ml混合物加到90 ml 细胞生长液，该培养液含终浓度为5%的胎牛血清。（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）；
（6）每个T-25细胞培养瓶加6 ml （600，000 细胞）悬液，剩余的细胞悬液可加到T-75细胞瓶用于细胞传代；通常6 ml细胞悬液数日可长成成片生长的细胞；
（7）于37℃培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态。
注：消化液除EDTA-胰酶外，也可以用0.25%胰酶与Versene 按照1：7的比例配成消化液使用。
每批胎牛血清均应进行血清测试，通过测试确定血清的最佳使用浓度，此处提到的血清使用浓度只是一个参考浓度。
（四）细胞的冻存
1．细胞冻存材料：
（1）成片的MDCK细胞：细胞生长良好存活率高，80％～90％成片。
（2）二甲基亚砜（DMSO）
（3）胎牛血清
（4）EDTA-胰酶 （0.05% 胰酶；0.53 mM EDTA. 4Na）
（5）移液管：1ml，10ml
2. 细胞冻存步骤
（1）冻存液的配置：
胎牛血清：9ml
二甲基亚砜：1ml
（2）细胞消化，消化过程同细胞培养的消化。
（3）细胞消化后，加入配置好的细胞冻存液，混匀后分装到细胞冻存管内。
细胞冻存浓度为1×106
（4）细胞冻存过程：4℃ 2小时，-20℃ 2小时，放入液氮长期保存。
（五）细胞的复苏：
冻存细胞复苏原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶对细胞造成伤害，而导致细胞死亡。细胞活化后，需要数日或继续传代一至二代，其细胞生长或细胞特性表现才会恢复正常。
1．材料：
（1）37OC恒温水浴箱
（2）细胞生长液 完全型D-MEM 9ml
胎牛血清 1ml
（3）T-25培养瓶， 无菌移液管
（4）70％～75％的酒精
2.细胞复苏步骤：
（1）将细胞生长液放入37℃回温，回温后以70％～75％的酒精擦拭，放入生物安全柜（无菌的操作台）内。
（2）自液氮中取出细胞冻存管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程盖子容易松掉。
（3）立即放入37℃水浴中快速解冻，轻轻摇动使其在1分钟内全部融化，以70％～75％的酒精擦拭保存管外部，移入生物安全柜（无菌操作台）。
（4）取出1.0ml解冻的细胞悬液，缓慢加入有生长液的细胞培养瓶内，混合均匀，放入培养箱培养。
（5）次日，更换细胞生长液。
（六）质量控制
在过量传代的情况下，MDCK细胞可能会失去其对呼吸道病毒的敏感性。因此实验室应保持低代次的细胞株在液氮中。为了保持该分离系统的敏感性，当细胞复苏后被连续传15～20代，达到40代以上时，在间隔期可以用已知滴度的阳性质控病毒来检验MDCK细胞系的敏感性。如果细胞的敏感性已经下降，即应复苏新的细胞株。所用细胞系应确保无支原体污染。
（七）MDCK细胞系的敏感性的检测
选择已知滴度的阳性质控流感病毒，做10－1……10－5稀释，取0.5ml分别感染早代的细胞株和现有的细胞株。3～5天后收获病毒液，检测早代细胞株与现有细胞株培养的病毒液间是否由差别。如有明显差别，表明现有细胞株敏感性已经下降，应重新复苏新的细胞株。
附件5
流感病毒鉴定技术指引
一、血红细胞凝集及红细胞凝集抑制实验
流感病毒的血凝素（HA）能够引起红细胞凝集，因此而得名。用于检测流感病毒滴度的红细胞凝集试验也是根据病毒的这一特性而建立的。当血清中特异性抗体与病毒血凝素结合后，则可以抑制红细胞凝集的出现。即为红细胞凝集抑制实验（HAI）的理论根据。
微量红细胞凝集抑制实验是目前最常用的一种鉴定流感病毒的方法。该方法简单、易行、结果可信。用于HAI的标准参照血清必须及时更新，最好包括当时的疫苗株和流行代表株。HAI中所用的血清必须经特殊处理以清除非特异性抑制素。
（一）生物安全要求
生物安全要求及个人防护要求与流感病毒的分离相同，并应遵守相应的生物安全规定。
（二）实验材料
1．国家流感中心提供的A（H1N1）、A（H3N2）、B型流感病毒的标准参照抗原与血清；
2．缓冲液和其他试剂：
（1）红细胞悬液（鸡、豚鼠、或人“O”型红细胞）
（2）磷酸缓冲液（PBS），0.01M， PH7.2
（3）生理盐水
（4）其他：
37℃水浴
56℃水浴
台式离心机
多道可调加样器
离心管
无菌纱布
96孔微量板：鸡红细胞选择：“V”型底微量板；豚鼠和人“O”型红细胞选择“U”型底微量板
（三）试剂配制
1．磷酸缓冲液（PBS），0.01M， PH7.2
25×倍 PBS缓冲液：2.74g Na2HPO4，0.79g NaH2PO4 加去离子水至100 ml；
2．工作液配制：25倍PBS缓冲液完全溶解后，取 40ml 25倍 PBS液，加入8.5g NaCl，加去离子至1000 ml。用1N NaOH 或1N HCl调整PH 至7.2。121℃高压灭菌15分钟，消毒后至4℃保存，保存期为3周；
3．生理盐水： 0.85% NaCl
20×母液：170g NaCl加入1000ml去离子水，高压灭菌，生理盐水（0.85%）： 20×母液50ml加入去离子水950ml，121℃高压灭菌15分钟，消毒后至4℃保存，保存期为3周；
4．阿氏液配制：
25 g葡萄糖
8.5 g柠檬酸钠
4.5 g NaCl
0.55 g柠檬酸
加去离子水1000ml，用1N NaOH 或1N HCl调整PH 至6.1，用0.22μm的细菌滤器过滤。
（四）红细胞悬液配制
1．取阿氏液中的红细胞，1200rpm离心5分钟，弃上清；
2．加入等量的PBS液体洗涤，充分混匀，1200rpm离心5分钟，弃上清；
3．PBS液体洗涤三次。最后一次洗涤后，1200rpm离心10分钟；
4．将红细胞稀释至合适的浓度。火鸡、鸡的红细胞，实验终浓度一般0.5%，如用人“O”型、豚鼠红细胞，终浓度为0.75%。
（五）实验步骤
1．RDE（受体破坏酶）处理标准参照血清
（1）1份血清加入4份RDE ，混合；
（2）37℃水浴过夜；
（3）56℃水浴加热30分钟，灭活RDE。
表1 流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较
红细胞
| 鸡
| 火鸡
| 豚鼠
| 人“O”型血
|
终浓度
| 0.5
| 0.5
| 0．75
| 0．75
|
孔底部形状
| V型
| V型
| U型
| U型
|
孵育时间
| 30分钟
| 30分钟
| 60分钟
| 60分钟
|
细胞对照
| 细胞沉积成泪滴状，倾斜时细胞向下流
| 细胞沉积成泪滴状，倾斜时细胞向下流
| 细胞沉积成环状
| 细胞沉积成环状
|
2．处理后血清中有无残留非特异性凝集素
（1）选用适当的微量板，从B1至H6中加入25μlPBS；
（2）A1到A5各加50μl处理后的血清，A6加50μlPBS；
用多道加样器从A1行开始，各孔取25μl血清，由A行至H行进行2倍稀释血清；
（3）H行各孔稀释混匀后其取25μl；
（4）每孔补加25μlPBS；
（5）每孔加入50μl红细胞悬液，混匀；
（6）置室温（22～25℃）孵育30～60分钟，观察有无凝集，如出现凝集则表示血清中有残余的非特异性凝集素。该血清必须用红细胞吸附去除非特异性凝集素后才能使用。
3．红细胞吸附去除非特异性凝集素：
（1）体积的红细胞可以去除20倍体积的RDE处理过的血清；
（2）红细胞与血清混匀后，置4℃一小时；
（3）1200rpm离心10分钟；
（4）小心吸取上清液；
（5）重复操作直至血清中的非特异性凝集素被去除。
4．红细胞凝集试验（HA）检测待检病毒滴度
（1）根据所用的红细胞种类选用适当的微量板。将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1成为第一列；平行方向称行，如A1～A12成A行；
（2）除第一列各孔外（A1～H1），其余每孔加50μlPBS；
（3）A1～F1各加100μl标准抗原或待检病毒。H1加100μlPBS作为阴性对照；
（4）用多道加样器从第一列各孔分别取50μl病毒液，由第一列至第12列做二倍系列稀释。最后一列每孔弃去50μl；
（5）每孔加入50μl红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合；
（6）室温孵育30～60分钟，观察血凝现象并记录结果；
（7）红细胞凝集以“＋”记录；只有部分红细胞凝集记录为“＋/-”；无凝集记录“-”。血凝滴度的判定以出现凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的血凝滴度。
5．制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位的抗原
（1）一个凝集单位指能引起等量的标准化的红细胞凝集的病毒量。进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个血凝单位的病毒量；
（2）制备4个单位血凝抗原时：首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。如每份血清作8孔稀释，每孔用抗原25μl抗原，那么测定一份血清须0.2ml抗原。根据标准血清的份数计算出实验所需病毒抗原量，然后配制抗原；
（3）其次，计算出病毒稀释度。用病毒的HA滴度除以8，得到的商即为4个血凝单位的稀释度。如，某病毒的HA滴度为64，除以8等于8。1：8（1ml病毒液加7mlPBS）稀释该病毒即可得到4个血凝单位。
注：红细胞凝集抑制试验中所用的4个血凝单位是指每25μl病毒液中含有4个血凝单位（等于50μl病毒液中含有8个血凝单位）。
为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误，新配制的4个血凝单位抗原须复核滴定：取50μl稀释好的抗原，用等量PBS做2倍系列稀释（同病毒滴定）后加入50μl红细胞悬液，至室温孵育30～60分钟观察凝集结果。如只有前4孔出现凝集，表明每50μl病毒含有8个血凝单位，该病毒稀释准确，可以用于红细胞凝集抑制试验。如第5孔也出现凝集，说明每50μl病毒含有16个血凝单位，该抗原必须等量稀释。如只有前3孔凝集，表明每50μl病毒仅含有4个血凝单位，病毒量须加倍。此外，4个血凝单位抗原必须每次用前新配制。
6．红细胞凝集抑制试验（HAI）鉴定未知病毒
本试验采用国家流感中心提供的流感标准参照抗原和抗血清
根据所用的红细胞选用适当的微量板
（1）除A行外，每孔各加25μl PBS。A5、A6各加50μlPBS作为阴性对照；
（2）国家流感中心提供以下4种抗血清：
抗A（H1N1）亚型血清
抗A（H3N2）亚型血清
抗B型Yamagata系病毒血清
抗B型Victoria系病毒血清
（3）A1至A4及A7至A10分别加入上述处理好的标准血清，每孔50μl；
（4）用多道加样器从A行分别取25μl血清，由A行至H行做2倍系列稀释血清，弃去H行25μl；
（5）A1至H5每孔加入25μl待检病毒液1（4个血凝单位的抗原）；
（6）A7至H10每孔加入25μl待检病毒液2（4个血凝单位的抗原）；
（7）对照孔（A5、A6）不加抗原，用25μlPBS代替；
（8）混匀，至室温孵育30～60分钟，观察红细胞凝集抑制试验结果；
（9）另取血凝板同样做标准血清对照。
当特定的抗体与相应的血凝抗原结合后，可以抑制病毒引起的红细胞凝集现象。红细胞凝集抑制效价是指抑制红细胞凝集出现时血清的最高稀释度的倒数。如1：80稀释的血清孔不出现凝集（完全抑制），1：160稀释的血清孔出现凝集（无红细胞凝集抑制），该血清对测定病毒的红细胞凝集抑制效价为80。
标准参照血清对待检抗原的抑制效价≥20才可以算为阳性。
一个待检抗原不能同时被两种或两种以上的标准血清抑制。
待检病毒与标准参照血清有交叉抑制，但与一种标准参照血清抑制效价大于其他参照血清4倍以上时，可以判定为此种流感病毒。
红细胞凝集抑制试验不仅可以用于鉴定待检病毒的型别及亚型，也常用于检测同型别病毒间的抗原性变异情况。
7．红细胞凝集抑制试验注意事项
（1）血红细胞凝集抑制试验必须用4个血凝单位/25μl的抗原，抗原必须新鲜配制；
（2）孵育时间准确，有些病毒引起的凝集现象因病毒游离消失很快，这时应将反应板放置4℃，或缩短孵育时间；
（3）红细胞悬液的配制必须标准化；
（4）正确存放试剂，避免反复冻融及污染；
（5）冻干的试剂应按照说明溶解，保存。
8．确定待检病毒的血凝抑制试验包括以下对照：
（1）红细胞对照；
（2）阴性对照血清，以防其它非特异性抗体的影响；
（3）标准血清对照，防止非特异性凝集素及抑制素的干扰；
（4）详细记录实验过程。
9．红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验的其他限制因素
（1）病毒在不同宿主中的生长能力。流感病毒的进化常常导致宿主范围改变。长期以来，分离培养流感病毒最常用的是鸡胚。但是近年来一些流行株很难用鸡胚分离成功，所以很多实验室改用MDCK细胞或原代猴肾细胞分离流感病毒。用细胞培养分离传代的病毒HA滴度一般较鸡胚传代病毒低。MDCK细胞传代数的高低影响其对病毒的敏感性，应尽量选用代数较低的细胞。
（2）病毒对各种红细胞的凝集能力。流感病毒能凝集禽类或一些哺乳类动物的红细胞。但是位于血凝素上受体结合部位的氨基酸发生点突变，则可影响病毒对某些红细胞的凝集能力。鸡红细胞是较常用的一种红细胞，因其方便易得、富余时间较短、红细胞凝集抑制结果清晰易读。但是近年来发现有些病毒，特别是新分离出的病毒或代数较低的病毒不能凝集鸡红细胞。如果遇到这种情况，应更换豚鼠红细胞。除此之外，火鸡红细胞也较常用。
（3）非特异性血凝抑制素。人和动物血清中都存在有非特异性抑制素。非特异性抑制素实质上是游离在血清中类似流感病毒受体的唾液酸残基。这些类似受体的多糖类物质能与病毒血凝素分子上的受体结合部位结合，因此用于血凝抑制或其它试验的血清必须彻底清除其中所含的非特异性血凝抑制素。人和动物血清中的非特异性血凝抑制素分为α、β、γ三种，这三种抑制素对不同的病毒的抑制能力不同。常用的清除非特异性血凝抑制素的方法有霍乱滤液（受体破坏酶的一种）清除法，过碘酸钾清除法等。
（六）红细胞凝集抑制试验（HAI）测双份血抗体
1.生物安全要求
生物安全级别：生物安全二级
如果采用灭活的流感病毒进行血清学诊断时，可以在生物安全一级实验室里进行操作，并应当遵守生物安全一级实验室的有关生物安全的规定。
2.实验材料
（1）待检血清：待检血清必须先经RDE处理去除非特异性抑制素；
（2）标准化的红细胞悬液；
（3）已知标准抗原（由国家流感中心提供的试剂盒内的4种标准参照抗原）：
A（H1N1）亚型代表毒株标准抗原
A（H3N2）亚型代表毒株标准抗原
B型Yamagat系代表毒株标准抗原
B型Victoria系代表毒株标准抗原
（4）制备4个血凝单位抗原：本试验选用A（H3N2）亚型病毒作为已知抗原。配制方法同前。
3.实验步骤
（1）根据所用红细胞选用适当的微量板，须设立血清对照板；
（2）除A行外，每孔加入25μlPBS 缓冲液；
（3）按以下顺序，再A行各孔加入处理过的血清50μl：
A1：待检血清标本1，急性期血清
A2：待检血清标本1，恢复期血清
A3：待检血清标本2，急性期血清
