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3、病毒分离
多采用鸡胚和MDCK细胞进行流感病毒分离。可先用MDCK细胞对原始标本进行筛选，MDCK细胞分离结果为阳性后，再将另外一份-70℃或以下冻存的原始标本用鸡胚进行病毒分离。
流感监测网络实验室收到标本后，要应及时进行标本处理和病毒接种。
（1）标本的处理：标本送至实验室后，立即进行处理。将原始标本分为三份，一份（30％）用于MDCK细胞接种，一份（40％）鸡胚接种，一份（30％）保存待复核。
（2）MDCK细胞的接种和收获
将处理后的标本接种于70％～90％成片的单层MDCK细胞上，每日观察并记录细胞病变（CPE）。当75％～100％细胞出现病变时进行收获。如细胞无病变也应于第7天收获。维持液经红细胞凝集（HA）试验阴性者，可继续盲传1～2代。HA试验结果仍为阴性者，则判断MDCK细胞病毒分离结果为阴性，标本可弃去。
（3）鸡胚的接种和收获
将处理后的标本接种于9日龄鸡胚的羊膜腔和尿囊腔，33℃～35℃培养72h，分别收获鸡胚尿囊液和羊水。经HA试验结果阴性者，将羊水和尿囊液混合，继续盲传1代（72h），如仍为阴性，则判断鸡胚病毒分离结果为阴性，标本可弃去。
（4）结果登记和录入
流感监测实验室的工作人员在完成病毒分离后，进行登记，或24h内将病毒分离结果录入“中国流感监测信息系统”中的“流感监测病毒分离、鉴定结果登记一览表”（表5）中。
4、病毒鉴定
（1）HA试验
MDCK细胞或鸡胚收获的标本首先用鸡、豚鼠或人红细胞进行HA试验，确定病毒滴度。“O”相毒株采用豚鼠或人红细胞进行HA试验。
HA滴度≥8者，进行HI试验；HA滴度＜8者，继续在敏感的MDCK细胞系或鸡胚上培养1～2代，若其HA滴度≥8，可进行红细胞凝集抑制（HI）试验；若传2代后HA滴度仍＜8，可用B型引物和能区分A型流感病毒不同亚型的引物进行核酸检测。不具备核酸检测能力的实验室可将分离物或原始标本送上一级流感实验室进行鉴定。
（2）HI试验
HA试验完成后，48小时送到省疾控中心流感监测网络实验室采用国家流感中心每年分发的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B（Victoria系）和抗B（Yamagata系）4种标准参照血清进行HI试验，以确定病毒的型别和亚型。进行HI试验时，需同时采用4种标准抗原作为对照。
（3）流感监测网络实验室的工作人员在完成病毒鉴定后，24h内将鉴定结果录入“中国流感监测信息系统”中“流感监测病毒分离、鉴定结果登记一览表”。
5、毒株的管理和寄送
（1）毒株的保存管理
全省流感监测实验室，要对所有流感毒株进行登记保存，参考使用“流感毒株保存记录表”（表6），以备复核。
毒株鉴定完成后，液体毒株可在-70℃及以下温度条件保存3年，干燥管可以长期保存。分离毒株的原始标本应保存6个月。
（2）寄送国家流感中心的流感毒株
自流感样病例监测哨点医院采集的标本分离所得全部流感毒株；单向血凝抑制效价与国家流感中心提供的标准参照血清相比有4倍或4倍以上差异的流感毒株；HA滴度＜8且用核酸检测不能分型的毒株；HA阳性，采用当年国家流感中心提供的标准参照血清进行HI试验，4种血清的HI效价均≤20的毒株。若所送毒株被WHO评选为国际疫苗株，对实验室所在疾控中心给予奖励。
（3）毒株上送的时限和要求
HA阳性且应用国家流感中心提供的标准参照血清进行HI试验，4种血清的HI效价均≤20的毒株，应在HI试验结束后24h内送达国家流感中心；
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