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2.3.2.4 向第1～11孔中加入25ml 4 HA单位的抗原，在微量振荡器上振荡30秒，室温下作用30分钟。
2.3.2.5 每孔加入25ml红细胞悬液，振荡30秒，放2～8℃下反应30～45分钟，判定结果。
2.3.3 每次测定时应设阴性血清对照和已知HI抗体效价的阳性血清对照。
2.3.4 结果判定 判定时将反应板倾斜45度。只有当阴性对照血清HI效价不高于1：8、阳性对照血清HI效价与已知结果相比误差不高于1个滴度时、抗原对照孔（第11孔）中红细胞完全凝集、血清对照孔（第12孔）中的红细胞完全沉淀时，试验结果方为有效。若红细胞沉淀呈泪珠样流淌，判为HI阳性；若红细胞在孔底均匀分布或呈锯齿状凝集，判为HI阴性。以完全抑制红细胞凝集的最高血清稀释倍数作为待检血清的HI抗体效价。
3 H9亚型禽流感血凝抑制（HI）试验抗原制造及检验标准
3.1 抗原制造
3.1.1 病毒繁殖 取A型禽流感病毒A/Chicken/Hebei/WD/98（H9N2）株生产用毒种，用SPF鸡胚繁殖病毒，收获鸡胚液。
3.1.2 灭活 取含毒鸡胚液，加入10%甲醛溶液，使其终浓度均为0.2%，37℃灭活24小时。
3.1.3 配制 灭活后的鸡胚液，加入灭菌甘油25%，充分混匀，定量分装，2～8℃保存。
3.2 检验
3.2.1 性状 白色或淡黄色液体。
3.2.2 装量检查 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。
3.2.3 无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
3.2.4 效价测定 按瓶签标明的量用灭菌生理盐水进行稀释，用微量法测定HA效价，应不低于1：128。
3.2.5 特异性检验 分别与ND、EDS76、H5亚型禽流感、H7亚型禽流感阳性血清，SPF鸡血清和H9亚型禽流感阳性血清作HI试验，抗原对H9亚型禽流感阳性血清应为阳性，对ND等其他阳性血清及SPF鸡血清应为阴性。
3.2.6 规格 1ml/瓶
3.2.7 贮藏与有效期 2～8℃保存，有效期为6个月。
4 H9亚型禽流感HI试验操作术式
4.1 取微量反应板，分别向1～11孔中加入25ml生理盐水，第12孔中加入50ml生理盐水。
4.2 吸取25ml血清，加至第1孔内，充分混匀后，吸取25ml至第2孔，依次2倍稀释至第10孔，从第10孔吸取25ml，弃去。
4.3 分别向1～11孔中加入含4HA单位的抗原25ml，室温下静置30～40分钟。
4.4 每孔中加入25ml 1%（V/V）鸡红细胞悬液，轻轻混匀，室温下静置30～40分钟。对照红细胞将呈显著纽扣状。
4.5 结果判定 将反应板倾斜后判定结果。当阴性对照血清HI效价不高于1：4、阳性对照血清HI效价与已知结果相比，误差不超过1个滴度时，试验方可成立。以完全抑制4 HA单位抗原的血清最高稀释度作为HI效价。
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