3.2 显色培养基
3.3 7.5 %氯化钠肉汤10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤
3.4 营养肉汤或BHI肉汤
3.5 营养琼脂
3.6 新鲜兔血浆或商品用凝固酶试验兔血浆
3.7 0.3%过氧化氢液
3.8 0.85%无菌生理盐水
4 金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序
金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序见图3。
图（略）
5 操作步骤
5.1 采样
5.1.1牛奶样品：到已选定的奶牛养殖场，现场采牛奶置入灭菌试管中，0-4℃保存，不超过48h。
5.1.2扁桃体、发病动物组织和上呼吸道拭子：无菌操作取发病动物组织和上呼吸道拭子，上呼吸道拭子置入灭菌试管中，0-4℃保存不超过48h。
5.1.3 吸取1mL牛奶样品或将上呼吸道拭子至盛有10mL 7.5%氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤中，振荡混匀。
5.2 增菌和分离培养
5.2.1 将上述样品匀液于36±1 ℃培养18～24 h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。
5.2.2 将上述培养物，分别划线接种到显色培养基平板上，无菌操作将发病动物组织直接划线， 36±1 ℃培养24～48h。
5.2.3 挑取可疑菌落。用营养琼脂纯化一代，待进一步细菌鉴定。
5.3 金黄色葡萄球菌的鉴定
5.3.1生化鉴定 将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行触酶试验，应为阳性。
将新鲜纯化、经触酶试验阳性待检细菌单个菌落，悬浮于5mL灭菌生理盐水，按照生化鉴定试条使用说明书操作， 37℃培养18-24h后判读结果。
5.3.2血浆凝固酶试验法 挑取显色平板上可疑菌落1 个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂平板，36±1℃培养18～24h。将在营养琼脂上培养24h以内的待鉴定细菌，首先进行触酶试验，应为阳性。
新鲜兔血浆制备：称取柠檬酸钠3.8g，加蒸馏水100mL，溶解后过滤，装瓶，121℃高压灭菌15min。取3.8%柠檬酸钠溶液一份，加兔全血四份，混好静置 （或以3000r/min 离心30 min），使血液细胞下降，即可得血浆。
取新鲜配置兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2～0.3 mL，振荡摇匀，置36±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。
四、动物源空肠弯曲菌的分离与鉴定
1 范围
本标准规定了动物源空肠弯曲菌的分离鉴定方法 。
本标准适用于粪便拭子和盲肠内容物中空肠弯曲菌的分离与鉴定。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌与培养设备外，其他设备和材料如下。
2.1 采样管
2.2 采样棉拭子
2.3 生物安全柜
2.4 恒温培养箱： 25℃±1℃，36℃±1℃，42℃±1℃。
2.5 恒温水浴锅：37℃～100℃。
2.6 微需氧条件：5%氧气＋10%二氧化碳＋85%氮气，或商品化微需氧包。
2.7 显微镜：10×～100×。
2.8 微生物生化鉴定系统或者生化鉴定拭条
2.9 高速冷冻离心机：≥12000r/min。
2.10 小型离心管：1.5mL。
2.11 微量加样器：1μL～1000μL。
2.12 吸头（与微量加样器相匹配）
2.13 PCR仪
2.14 微波炉
2.15 电泳仪
2.16 电泳凝胶成像分析系统（或紫外透射仪）
3、培养基和试剂
3.1 标准菌株：空肠弯曲菌标准菌株（ATCC 33560）
3.2 DNA Marker
3.3 引物及扩增片段长度
3.3.1 引物
上游 5’ CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT 3’
下游 5’ AAG ATA TGG CAC TAG CAA GAC 3’
扩增片段长度为 773bp
3.4 运送培养基
3.5 弯曲菌选择性（CCD）培养基
3.6 哥伦比亚血琼脂培养基
3.7 生理盐水
3.8 10 ×PCR 缓冲溶液Ⅱ
3.9 氯化镁溶液（25mM）
3.10 Taq 聚合酶（0.5U/μL）
3.11 dNTPs（2mM）
3.12 琼脂糖
3.13 50×TAE缓冲液：将242gTris碱，57.1mL冰乙酸，100mL0.5M EDTA（pH8.0），加纯水至1000mL。
1×TAE缓冲液： 临用时将50×TAE缓冲液1份加蒸馏水49份，混匀即可。
3.14 上样缓冲液
3.15 溴化乙锭溶液（10mg/mL）：称取1g溴化乙锭溶于100mL水中，用磁力搅拌器搅拌数小时直至完全溶解，避光冷藏（4℃）保存。
3.16 矿物油
4 空肠弯曲杆菌的分离与鉴定程序
空肠弯曲杆菌的分离与鉴定程序见图4。
图4（略）
5 操作步骤
5.1 分离与纯化
5.1.1 分离
将新鲜或者运送培养基中的粪便拭子或盲肠内容物在CCD培养基上涂抹，用经火焰灭菌并冷却的接种环与涂抹处垂直划线。
5.1.2 培养
将上述接种后的平板置于42℃±1℃恒温培养箱中，在微需氧条件下培养24h～48h。
5.1.3 纯化
观察24h培养与48h培养的琼脂平板上的菌落形态。挑取灰色、湿润、凸起、光滑圆润、边缘整齐的可疑单菌落，按3.2的培养条件培养纯化。
5.2鉴定
5.2.1生化鉴定
对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定，并进行结果判定。或者通过5.1～5.4的试验进行分子生物学（PCR）鉴定。
5.2.2 分子生物学（PCR）鉴定
用接种环从哥伦比亚血琼脂培养基上挑取适量的纯培养物置于盛有0.5mL生理盐水的小型离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。再加0.5mL灭菌水，悬浮并涡旋混匀，100℃沸水中煮沸10min后，取出置于冰浴中冷却5min后，12000r/min（4℃）离心2min，取上清作为PCR模板。
5.2.2.1 PCR反应体系
根据不同厂家PCR试剂用量，配制PCR反应体系。同时设立阴性和阳性对照。
5.2.2.2 PCR反应条件
采用的PCR反应条件见下表。
PCR反应程序表
5min， 94℃
1min，94℃，1min，64℃，1min，72℃，2*
1min，94℃，1min，62℃，1min，72℃，2*
1min，94℃，1min，60℃，1min，72℃，2*
1min，94℃，1min，58℃，1min，72℃，2*
1min，94℃，1min，56℃，1min，72℃，2*
1min，94℃，1min，54℃，1min，72℃，30*
10min，72℃
|
